Neocarazostatin A是微生物来源的三环咔唑生物碱家族的代表性化合物,具有很强的自由基清除活性。其结构中含有一个咔唑单元,不含其它稠环或单环,以及一个少见的C-6位异戊烯基取代。同位素喂养实验显示微生物来源三环咔唑生物碱的生物合成机制不同于已报道的其它来源咔唑碱。本研究通过化学挖掘和发酵提纯从土壤微生物Streptomyces sp. MA37的代谢产物中分离了neocarazostatin A,并对其生物合成展开了以下几方面的研究：首先,以YerE为诱饵对MA37的基因组序列进行扫描,结合基因插入失活实验,最终定位了neocarazostatin A的生物合成基因簇,并将其命名为nzs。该基因簇包含10个基因,覆盖17.8 kb染色体区域。生物信息学分析显示,它们编码的酶蛋白中,NzsB-F负责前体的供应,NzsH-J负责骨架的装配,NzsG和NzsA负责骨架合成后的修饰。其次,本研究对异戊烯基转移酶NzsG进行了体内和体外功能表征。生物信息学分析显示NzsG与角鲨烯合成酶同源性较高。对nzsG进行同框缺失后,其突变株累积了streptoverticillin和precarazostatin两个新化合物。结构鉴定发现,它们在C-6位都没有发生异戊烯基化,从而证明NzsG其实是一个异戊烯基转移酶。随后,对NzsG的体外功能表征发现,该酶可以把precarazostatin转化成neocarazostatin B,而不能转化streptoverticillin。说明streptoverticillin是副产物而precarazostatin是中间体。接着,以precarazostatin、吲哚衍生物和FPP为底物对NzsG进行了生化表征,进一步证实NzsG是金属离子依赖的且具有严谨底物选择性的异戊烯基转移酶。这也是发现的第一例咔唑环特异性的异戊烯基转移酶。本研究接着对羟化酶NzsA进行了功能验证。生物信息学分析显示nzsA编码一个P450单加氧酶,其同框缺失突变株累积了neocarazostatin B和16,17-epoxyneocarazostatin B两个新化合物。对其结构鉴定发现,它们的C-10位都没有羟基,从而证实了NzsA的羟化酶功能。随后,我们对NzsA进行了超量表达、纯化和生物转化实验。NzsA可以将neocarazostatin B转化成neocarazostatin A,而不能转化16,17-epoxyneocarazostatin B,说明16,17-epoxyneocarazostatin B是副产物而neocarazostatin B是中间体,从而确定NzsA负责C-10位的羟化反应。随后,以precarazostatin为底物对NzsA和NzsG进行了串联转化实验,发现precarazostatin可以经neocarazostatin B转化成neocarazostatin A,从而证明在neocarazostatin A生物合成途径中NzsG作用于NzsA之前,它们共同负责neocarazostatin A生物合成过程中碳骨架的异戊烯基化和羟化等级联修饰步骤。我们还对基因簇中其它基因进行了功能研究。结果显示,前体供应相关基因nzsB、nzsC和nzsD的缺失不影响neocarazostatin A的产生。敲除nzsE、nzsF和3个骨架装配相关基因nzsH、nzsI和nzsJ后,neocarazostatin A不再产生。由此证明,nzsB-D为非必需基因,而其它基因是neocarazostatin A生物合成所必需。根据以上结果,本研究推导了neocarazostatin A的生物合成途径。色氨酸经过转氨基作用变成吲哚-3-丙酮酸,吲哚-3-丙酮酸接着与丙酮酸反应加载骨架上的C-2和C-13单元,随后与ACP上挂载的羟基丁酰反应完成咔唑骨架碳原子的加载,之后经过脱羧、环化、重排、氧化、还原和甲基化生成precarazostatin,后者经过NzsG的异戊烯基化和NzsA的羟化生成终产物neocarazostatin A。总之,本研究首次揭示了细菌来源的三环咔唑生物碱的生物合成途径,特别是对neocarazostatin A生物合成途径中的异戊烯基转移酶和羟化酶所参与的级联修饰步骤进行了深入研究,为后续对其“A环”这一特殊结构的生物合成研究提供了重要线索,也为该家族其它成员的生物合成途径的全面揭示提供了参考。