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目的:探究RNA甲基转移酶METTL3介导的m~6A修饰对缺氧诱导视网膜血管新生的调控作用及其机制。方法:1、利用21%O2和1%O2体外构建人脐静脉内皮细胞（Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）缺氧模型,实验分3组:对照组（Ctrl）、24 h低氧培养组（24 h）和48 h低氧培养组（48 h）;利用75%O2在体构建氧诱导视网膜病变小鼠模型（Oxygen-induced retinopathy,OIR）,实验分2组:对照组（Ctrl）和相对缺氧组（Hypoxic）。采用ELISA定量检测法（比色法）、RNA斑点杂交（Dot blot）实验,在细胞水平和动物水平检测m~6A修饰丰度;采用q RT-PCR和Western blot实验,在细胞水平和动物水平检测m~6A修饰关键调控酶的表达变化,探究m~6A修饰与视网膜血管新生的相关性;利用scrambled（Scr）si RNA、HIF-1αsi RNA（si1α）、HIF-2αsi RNA（si2α）和HIF-1α+HIF-2αsi RNA（double knockdown,DKD）转染HUVECs,在正常氧（Normoxic）和缺氧（Hypoxic）条件下,采用q RT-PCR和Western blot实验检测METTL3的表达情况,探究缺氧诱导的m~6A修饰丰度变化在缺氧诱导视网膜血管新生过程中的作用模式。2、细胞水平上,利用scrambled（Scr）si RNA、METTL3（M3）si RNA?、pc DNA3.1 vector和pc DNA 3.1-METTL3转染HUVECs,实验分6组:空白对照组（Ctrl）、阴性对照下调组（Scr si RNA）、METTL3下调组1（M3 si RNA 1）、METTL3下调组2（M3 si RNA 2）、阴性对照过表达组（vector）和METTL3过表达组（M3OE）。采用MTT实验、Ki67染色、Transwell实验和成管实验,检测HUVECs活力、增殖、迁移和成管能力;动物水平上,利用内皮特异性METTL3敲除鼠(METTL3flox/flox;Cdh5-Cre)和对照鼠(METTL3+/+;Cdh5-Cre)构建角膜碱烧伤模型和OIR模型,实验分2组:对照组（Ctrl）和敲除组（METTL3-ec KO）。采用Isolectin B4（IB4）染色,检测角膜、视网膜新生血管数量,探究METTL3对血管内皮细胞和视网膜血管新生的调控作用。3、在HUVECs中利用pc DNA3.1载体过表达METTL3,采用m~6A免疫共沉淀高通量测序（Me RIP-seq）技术结合生物信息学预测,寻找METTL3作用靶标和信号通路;在HUVECs中过表达或沉默METTL3,采用m~6A-q PCR和Western blot技术,筛选靶通路中与METTL3最相关的潜在作用靶点;在HUVECs中过表达METTL3联合抑制靶通路,采用MTT实验、Ki67染色、Transwell实验和成管实验,检测HUVECs活力、增殖、迁移和成管能力,探究METTL3调控视网膜血管新生的作用靶标。4、在HUVECs中分别过表达m~6A阅读器（YTHDF1、YTHDF2、YTHDC2或YTHDC1）,采用Western blot和RIP-q PCR实验,检测靶蛋白的表达水平,确定特异性m~6A阅读器;在HUVECs中沉默METTL3联合过表达m~6A目标阅读器,采用Western blot实验,再次验证靶蛋白,采用Ki67染色、Transwell实验和成管实验,从细胞水平验证m~6A目标阅读器;在HUVECs中过表达m~6A目标阅读器联合抑制蛋白翻译起始因子,采用Western blot实验,验证m~6A目标阅读器对靶蛋白的调节作用,探究METTL3调控视网膜血管新生的作用机制。结果:1、ELISA定量检测法（比色法）和RNA斑点杂交（Dot blot）实验结果显示:缺氧诱导下,HUVECs和视网膜组织m~6A表达丰度增加,其中以m~6A甲基转移酶METTL3的时间梯度表达差异性最大,表明缺氧可诱导METTL3介导的m~6A修饰水平增加;q RT-PCR和Western blot实验结果显示:下调HIF相关蛋白表达可减少缺氧诱导的METTL3表达上调,表明缺氧诱导的METTL3表达上调是由HIF依赖模式介导的。2、Ki67染色、Transwell实验和成管实验结果显示:在HUVECs中沉默METTL3后,HUVECs的细胞活力下降,增殖、迁移和成管能力均下降,表明METTL3沉默可抑制内皮细胞血管新生能力;IB4染色结果显示:在体特异性敲除小鼠内皮细胞METTL3(METTL3flox/flox;Cdh5-Cre)后,角膜碱烧伤小鼠角膜和OIR小鼠视网膜新生血管数量均减少,表明在体特异性敲除METTL3可抑制病理性新生血管生成。3、Me RIP-seq结果显示:在HUVECs中过表达METTL3后,局部甲基化水平增加,其中429个基因m~6A甲基化水平增加,145个基因m~6A甲基化水平降低;GO/KEGG分析和IGV plots结果显示:过表达METTL3主要影响Wnt信号通路及其相关蛋白表达（DVL1、LRP6和CRAM1）,说明Wnt信号通路可能是METTL3的介导的m~6A修饰的靶通路;m~6A-q PCR和Western blot结果显示:在HUVECs中沉默METTL3表达可降低DVL1和LRP6表达水平,而过表达METTL3可增加DVL1和LRP6表达水平,说明METTL3通过靶向DVL1和LRP6调控Wnt信号通路;Ki67染色、Transwell结晶紫和成管实验结果显示:相较于单纯过表达METTL3,过表达METTL3联合抑制Wnt通路后,HUVECs的增殖、迁移和成管能力均下降。以上结果表明METTL3通过Wnt信号通路及其相关蛋白DVL1和LRP6发挥调控内皮细胞血管新生能力。4、Western blot和RIP-q PCR实验结果显示:YTHDF1过表达可增加Wnt信号通路相关蛋白（DVL1和LRP6）表达水平,同时可部分恢复沉默METTL3导致的Wnt信号通路相关蛋白DVL1和LRP6的表达下降;Ki67染色、Transwell结晶紫和成管实验结果显示:YTHDF1过表达可部分挽救METTL3沉默导致的HUVECs血管新生能力下降。以上结果表明METTL3通过m~6A阅读器YTHDF1依赖模式调控Wnt信号通路相关蛋白DVL1和LRP6表达;使用Rapamycin（Rap）抑制帽依赖性翻译后,Western blot实验结果显示:Wnt信号通路相关蛋白DVL1和LRP6的表达量下降。以上结果表明YTHDF1通过帽依赖模式调节Wnt信号通路相关蛋白的翻译过程。结论:RNA甲基转移酶METTL3介导的m~6A修饰通过调控血管内皮细胞功能调控缺氧诱导的视网膜病理性血管新生;METTL3介导的m~6A修饰通过调控Wnt信号通路及其相关蛋白（DVL1和LRP6）调控视网膜病理性血管新生;METTL3通过阅读器YTHDF1依赖模式调控血管内皮功能;阅读器YTHDF1通过帽依赖模式调节Wnt信号通路相关蛋白（DVL1和LRP6）的翻译过程。