KEAP1/NRF2/ARE信号通路调控线粒体自噬在SH-SY5Y氧糖剥夺再灌注损伤中的作用

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目的线粒体分裂和融合、线粒体自噬等的调控在维持线粒体稳态中发挥关键作用,而线粒体稳态是维持细胞功能、减轻脑缺血再灌注损伤的关键。本研究旨在探讨脑缺血再灌注过程中KEAP1/NRF2/ARE信号通路的激活及其对线粒体自噬的调控作用。方法我们利用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y氧糖剥夺模型模拟脑缺血再灌注损伤,将细胞培养至生长状态良好,密度约70%后,随机分成四个组:(1)正常组(C组):进行正常培养,不做任何特殊处理;(2)缺血/再灌注组(I/R组):将细胞氧糖剥夺4h后,恢复氧糖供应继续培养18h,即构建缺血/再灌注模型成功;(3)鸦胆子苦醇+缺血/再灌注组(Bru+I/R组):缺血缺氧前4h加入KEAP1/NRF2/ARE信号通路抑制剂鸦胆子苦醇(Brusatol,Bru)100nM,随后进行缺血缺氧再灌注过程;(4)赋形剂组(Veh+I/R组):缺血缺氧前4h加入二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO),因其细胞毒性,将终浓度控制于<0.1%,随后进行缺血缺氧再灌注过程。使用透射电子显微镜来观察线粒体超微结构。Western blot方法检测各组细胞中通路相关蛋白KEAP1、NRF2的表达,线粒体分裂相关蛋白Drp1、Fis1的表达,细胞凋亡相关蛋白BAX、BCL-2的表达和线粒体自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1、TOM20及P62的表达。荧光显微镜定性观察NRF2蛋白由细胞质向细胞核内的转位。活细胞/死细胞双染及细胞增殖/毒性检测试剂盒检测细胞活力。流式细胞术测定细胞凋亡率。结果1.与C组相比,I/R组细胞线粒体自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表达水平升高,P62、TOM20蛋白表达水平降低(P<0.05),电镜观察到双层膜包裹的自噬小体,包裹着损伤的线粒体结构,证明脑缺血再灌注过程中线粒体自噬被激活。2.与C组比较,I/R组细胞的KEAP1蛋白表达水平降低,细胞核内NRF2蛋白表达水平升高(P<0.05),免疫荧光实验观察到分布于细胞质内的NRF2蛋白向细胞核内发生转位,证明脑缺血再灌注过程中KEAP1/NRF2/ARE通路被激活。3.Bru+I/R组加入了通路抑制剂鸦胆子苦醇,蛋白免疫印迹试验测得细胞核内NRF2蛋白表达水平明显降低(P<0.05),免疫荧光未观察到NRF2蛋白向细胞核内的转位,说明KEAP1/NRF2/ARE通路被抑制。与I/R组比,Bru+I/R组抑制通路后,线粒体自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表达水平降低,P62、TOM20表达水平升高(P<0.05),透射电镜下未观察到线粒体自噬结构,线粒体自噬被抑制。证明KEAP1/NRF2/ARE通路调控线粒体自噬。4.与I/R组比,Bru+I/R组抑制通路及线粒体自噬后,线粒体分裂相关蛋白DRP1、FIS1蛋白表达水平升高,促凋亡蛋白BAX水平升高,凋亡抑制蛋白BCL-2表达水平降低,活细胞数量减少,流式细胞术测得细胞凋亡率升高。证明KEAP1/NRF2/ARE通路及线粒体自噬被抑制后,分裂的线粒体增多,凋亡率升高,细胞损伤加重。结论在脑缺血再灌注过程中,KEAP1/NRF2/ARE信号通路能够激活线粒体自噬清除受损的线粒体,维持线粒体稳态,从而减少细胞凋亡,发挥脑保护作用。
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