胃癌(gastric cancer,GC)是全球死亡率第二位的恶性肿瘤,胃癌的发病率高,治疗效果差,根治率低,在消化道肿瘤中发病率和死亡率占第一位,是危害人类健康的主要恶性肿瘤之一。全球42%的胃癌患者发生在中国,每年新发病例数仅次于日本位居世界第二,并有逐年上升趋势。尽管随着手术、化疗、放疗和分子靶向治疗技术的发展和综合治疗的应用,延长了部分早期胃癌患者的生存期,但晚期胃癌5年生存率仅10%-20%,中位生存时间不超过1年。因此对于胃癌的现况应该引起足够的重视,而胃癌的发生机制的研究对于指导胃癌治疗至关重要。肿瘤的发生发展是一个多步骤,多基因参与的过程,包括遗传学和表观遗传学的改变。但是由于技术的限制,很多机制尚未阐明。随着基因测序和编辑技术的出现和发展,包括全基因组测序,转录组测序,外显子测序,以及CRISPR/Cas9等基因打靶技术,从基因和分子水平更好的了解肿瘤的发生。MACFl作为一种细胞骨架连接因子,可以与细胞骨架组分微丝微管相结合,并在细胞的生长发育以及维持组织结构完整性中发挥相当作用。MACFl是一种细胞骨架交联因子,同时也是首个被认为表达范围广泛并且能够结合微丝微管细胞骨架的蛋白质,它的作用主要是调节微管微丝的运动,参与细胞信号转导通路,以及胚胎发育和疾病发生。然而,从1995年MACF1的发现到现在关于MACF1的研究仅停留在其细胞内的结构和细胞亚定位,对于其功能的研究非常少。最近几年随着全基因组测序技术的发展,MACF1在很多肿瘤的全基因组测序中被发现有一定的突变率,包括乳腺癌,胃癌,结肠癌等,才使MACFl的相关研究得到了更多的重视。尤其在胃癌中突变率为5%,大部分为移框突变。另外研究发现MACF1参与了Wnt信号转导通路,并通过调节微管稳定性以应对信号通路的激活。MACF1在信号转导通路中的作用也支持MACF1可能参与了肿瘤的发生发展。但是MACF1在肿瘤发生发展中作用机制国内外尚未见报道。CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)作为一种最近几年才发现的新的基因打靶技术,是原核生物中的调控RNA为了抵御病毒和质粒入侵,而引导Cas9核酸内切酶在目的片段错配修复造成DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)和基因的突变。CRISPR/Cas系统的高效基因组编辑功能已被应用于多种生物,包括人、斑马鱼、鼠、秀丽隐杆线虫、细菌及植物。相对于目前已经广泛应用的RNAi技术的靶标是m RNA,而CRISPR则是通过RNA识别DNA序列然后再改变DNA序列,其DNA编辑功能是可以遗传的。由于编码m RNA的DNA序列只占总DNA的极少部分,因此靶向DNA序列的CRISPR的靶标要比RNAi广得多,更有可能筛选出针对某DNA序列的特异CRISPR靶标。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活样效应核酸酶(Transcription activator-like effector nucleases,TALEN)相比较,CRISPR/Cas系统介导的基因组靶向实验在真核细胞中具有相似甚至更高的效率。鉴于以上原因,本研究拟探讨MACF1在胃癌中的表达情况及预后的关系,为胃癌的早期诊断和治疗提供理论依据。并采用CRISPR/Cas9基因打靶技术,敲除胃癌细胞系中的MACF1基因的表达,观察细胞生物学行为及功能的变化,从而研究MACF1在胃癌发生发展机制中的作用。本研究主要分为以下三个部分:第一部分MACF1在胃癌中的表达情况及与临床预后之间的关系目的探讨MACF1蛋白在胃癌组织中的表达情况及其与临床病理学特征和临床预后之间的关系材料和方法1.构建组织芯片并采用免疫组化法(IHC)检测MACF1在107例胃癌组织及107例相对应正常组织的胃癌上皮中的表达情况;2.对所有患者进行随访,获得5年随访资料,并结合MACF1在胃癌上皮组织中的表达情况,分析MACF1表达与临床病理和预后之间的关系;3.免疫组化结果分析和判定:每张芯片免疫组化结果均由3位病理科医师进行双盲评价,芯片上的每个点评价至少5个高倍视野,每个高倍视野下的细胞不应少于100个。然后根据免疫组化的着色强度和着色范围进行综合评价,具体如下:(1)细胞着色强度:0分,细胞无着色;1分,浅黄色;2分,棕黄色;3分,棕褐色。(2)阳性肿瘤细胞数占同类肿瘤细胞数的百分比:0分,无阳性细胞;1分,<10%;2分,10%~50%;3分,>50%。两项乘积为最终评分,包括0、1、2、3、4、6、9。分别为0阴性,1、2弱阳性,3、4中等阳性,6、9强阳性;4.统计学处理:应用SPSS21.0统计分析软件对所得实验数据进行处理。采用Spearman相关分析进行有序变量之间的联系的分析,采用Pearson’s卡方检验分类变量之间的比较;采用Kaplan-Meier法分析MACF1表达与胃癌患者生存预后之间的关系并绘制生存曲线,采用log-rank检验比较组间的差异;采用Cox风险模型进行多因素分析,评估各个指标对患者的预后生存的独立影响,包括患者的年龄、性别、肿瘤大小、浸润深度、分期和淋巴结转移等等,从而分析与胃癌患者预后生存相关的独立危险因素。P<0.05时有统计学差异,双侧检验。结果1.免疫组化结果显示:在107例胃癌癌旁正常组织中,24例染色阳性(22.4%),83例染色阴性(77.6%);107例胃癌组织中,76例染色阳性(71.0%),31例染色阴性(29.0%)。MACF1蛋白在胃癌组织中的表达率为71%(76/107),明显高于其相应的癌旁正常胃粘膜组织22.4%(24/107),且差异具有统计学意义(p<0.05);2.MACF1过表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转和肿瘤分期密切相关,并有统计学意义(p<0.05);3.总体胃癌术后患者5年生存生存率42.5%(45/107),MACF1蛋白表达升高的胃癌患者的5年生存率35.2%(25/76)明显低于MACF1蛋白低表达的胃癌患者的5年生存率55.6%(20/31),且差异具有统计学意义(p=0.034);4.MACF1的过表达、临床分期、淋巴结的转移个数都是胃癌患者术后总体生存率的独立预后因素。第二部分CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因改造胃癌细胞系目的探讨MACF1在不同胃癌细胞系中的表达情况及并利用CRISPR/Cas9基因打靶技术靶向敲除MACF1以获得突变型胃癌细胞系。材料方法1.采用荧光实时定量PCR(Q-PCR)和蛋白印迹(Western-blot)的方法检测MACF1在5个不同的胃癌细胞系AGS、HGC-27、SNU-1、KATO-III、NCI-N87中的表达情况,筛选表达量较高的细胞系;2.MACF1 CRISPR/Cas9载体构建:将MACF1的全基因组序列输入Vector NTI软件中,选定合适外显子并在Zifit工具网站中获取合适的sg RNA序列,并加入Bsa I酶切位点,CRISPR/Cas9及引导的sg RNA转染目的细胞后,Cas9在切割基因组的同时也会切割同样含有靶序列的质粒reporter,将sg RNA和reporter合成后,稀释退火,连接转化、挑菌、扩大培养,质粒提取;3.通过转染EGFP绿色荧光蛋白,筛选转染质粒与Lip2000的最佳转染比例:质粒的质量与Lip2000体积比例分别为1:1、1:2、1:3、1:4、1:5,转染48小时后观察细胞转染情况,选取最佳转染比例;4.使用Lip2000分别将sg RNA、reporter、cas9转染进JH293工具细胞,筛选切割效率较高的sg RNA;5.使用Lip2000分别将切割效率较高的sg RNA、reporter、cas9转染进工具细胞目的细胞AGS、SNU-1,48小时后观察转染效率;6.流式分选细胞仪分选目的细胞:将转染后细胞消化制备单细胞悬液,在流式细胞仪中分选单个目的细胞,种于96孔板中;7.单克隆细胞的培养及细胞收集:培养1-2周后,观察96孔板中的单克隆细胞团,待96孔板中的细胞长至50%左右时,分至另一96孔板中;8.筛选MACF1敲除细胞系并T7错配酶鉴定:分别提取改造后的AGS/SNU-1细胞系的基因组并进行PCR扩增,纯化回收产物进行自身退火T7错配酶切鉴定;错配鉴定成功的单克隆细胞系送测序;9.DNA测序并分析测序结果;10.Western-blot验证得到的细胞株。结果1.Q-PCR和Western-blot结果显示:MACF1在5个不同的胃癌细胞系AGS、HGC-27、SNU-1、KATO-III、NCI-N87等均有表达,且Q-PCR与WB二者结果基本一致,均为NCI-N87表达量最高,其次为AGS、SNU-1、HGC-27、KATO-III;2.成功构建MACF1 CRISPR/Cas9载体,共构建5个sg RNA、2个reporter,并转化、摇菌、扩大培养,提取质粒;3.质粒与Lip2000最佳转染比例分别为:AGS 1:2、HGC-27 1:2、SNU-1 1:3、KATO-III 1:3、NCI-N87的Lip2000转染效率极低;4.JH293工具细胞筛选的sg RNA和reporter分别为reporter1、sg RNA2;5.成功将sg RNA2和reporter1转染进入AGS和SNU-1,48小时后流式分选6.流式分选AGS和SNU-1的单细胞悬液,种于96孔板中,每个细胞分别收集4个96孔板;7.单克隆细胞团形成后,并长成96孔板的50%,分盘培养,AGS细胞平均单克隆形成率为19/96(19.79%),SNU-1细胞平均单克隆形成率为25/96(25.78%)。AGS细胞存活率48.68%;SNU-1细胞存活率46.46%。8.T7错配酶切鉴定:37个AGS细胞株有10个酶切鉴定结果为阳性,阳性率27%;SNU-1共验证8株,其中7个鉴定结果为阳性,阳性率为87.5%;将阳性的AGS和SNU-1全部送测序。9.DNA测序并筛选AGS野生细胞系2株,纯合突变(正负)2株,杂合突变(负负)5株;SNU野生细胞系2株,一条染色体敲除细胞系2株,两条染色体同时敲除细胞系6株;10.Western-blot验证得到的细胞株,MACF1基因纯合突变细胞系蛋白表达缺失,MACF1杂合突变细胞系蛋白表达较MACF1野生型减少。第三部分MACF1基因敲除对胃癌AGS细胞系体外生物学行为的影响目的探讨CRISPR/Cas9靶向敲除MACF1基因后对胃癌AGS细胞系生物学行为的影响。材料方法1.MTS法检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞增殖能力的影响;2.细胞划痕实验检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的迁移能力的影响;3.平板克隆检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的克隆形成能力的影响;4.软琼脂克隆形成检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的克隆形成能力的影响;5.Transwell实验检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞的迁移能力的影响;6.流式细胞仪检测敲除MACF1对胃癌AGS细胞周期的影响。结果1.MACF1敲除后的胃癌AGS细胞形态变化,梭形变为类圆形;2.MTS结果显示MACF1敲除后胃癌AGS细胞增殖能力减弱;3.细胞划痕实验结果显示MACF1敲除后胃癌AGS细胞增殖能力减弱;4.平板克隆形成实验结果显示MACF1敲除后胃癌细胞克隆形成能力减弱;5.软琼脂克隆形成实验结果显示MACF1敲除后胃癌细胞克隆形成能力减弱;6.Transwell结果显示MACF1敲除后胃癌AGS细胞的迁移能力减弱;7.流式结果显示MACF1敲除后细胞阻滞在G2/M有丝分裂期。结论1.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表达可以使胃癌细胞形态变化,细胞极性消失,形态由梭形变为类圆形,可能与MACF1蛋白参与细胞骨架形成有关;2.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表达可以使胃癌细胞的增殖迁移和侵袭能力下降,可能与MACF1蛋白参与细胞间粘附有关;3.CRISPR/Cas9敲除MACF1基因的表达可以使细胞阻滞在G2/M期,即有丝分裂期,可能MACF1通过调节微丝微管的连接参与了细胞的有丝分裂。