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微生物天然产物结构类型复杂,生物活性多样,是临床、农业及畜牧业药物的重要来源,如抗生素、抗癌药物、免疫抑制剂和抗虫药等。在过去的几十年中,放线菌一直是微生物天然产物的主要来源。随着基因测序技术的发展,研究者从一直被忽视的伯克氏菌中挖掘到越来越多的活性天然产物。基于“Red/ET重组工程”的多种微生物重组酶系统和基因簇异源表达平台的建立,为微生物天然产物的挖掘提供了有力的技术支撑。本研究聚焦于唐菖蒲伯克氏菌(Burkholderia gladioli)ATCC 10248中非核糖体肽类天然产物的挖掘,首先建立ATCC 10248的遗传操作体系,利用该体系对6个未知的NRPS基因簇进行原位激活和失活,成功激活两个基因簇,得到多个新型脂肽类化合物;并利用Red/ET重组工程成功克隆NRPS基因簇BGC7。主要研究结果如下:建立B.gladioliATCC 10248的遗传操作体系。首先测定常用抗生素对ATCC 10248的最低抑制浓度,结果表明,卡那霉素、安普霉素和庆大霉素可用于菌株遗传操作过程中的抗性筛选。然后对来源于大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)嗤菌体和伯克氏菌(Burkholderiales)的三种重组酶系统gbaA、gBAS和Redγ-Redαβ7029,通过基因敲除实验进行重组效率比较,结果表明,来源于P.aeruginosa噬菌体的gBAS重组酶系统只需50 bp的同源臂即可介导ATCC 10248体内高效的同源重组。原位激活B.gladioli ATCC 10248中的未知基因簇BGC2和BGC5,得到多个新型脂肽类化合物。首先利用gBAS重组系统对ATCC 10248中6个未知的NRPS基因簇进行强启动子插入激活和基因插入失活修饰,成功激活BGC2和BGC5。然后通过硅胶柱层析初步分离及HPLC制备,从BGC2的激活突变株中分离到5个代谢产物(化合物1、3、5,混合物2、6),从BGC5的激活突变株中分离到2个代谢产物(化合物7和9),通过核磁共振光谱鉴定了以上产物的结构,并通过HRMS/MS分析及同位素标记底物喂养实验推测了 4和8的结构,均为新型脂肽类化合物。利用Red/ET重组工程成功克隆NRPS基因簇BGC7。由于利用gBAS重组系统未能将BGC7成功原位激活,因此利用Red/ET重组工程对BGC7进行直接克隆,并将基因簇的启动子替换为组成型强启动子Pgenta,随后在E.coli GB05-MtaA、B.thailandensis E264、Burkholderiales DSM 7029 等多个异源宿主中表达,但仍未激活成功。原因可能在于次级代谢产物生物合成基因簇在微生物体内受到复杂的级联调控,仅通过单一的激活方法无法激活级联反应中的其他步骤。