【目的】华蟾毒精是临床常用传统中药蟾酥的主要有效成分之一,但是目前华蟾毒精的抗肿瘤分子靶标仍不明确。本研究利用Drug Target Seq策略来发现华蟾毒精在结肠癌细胞中的分子靶标,并通过多种鉴定方法和功能实验进行靶标验证。【方法】利用CCK-8实验检测蟾酥各活性成分毒性大小;根据Drug Target Seq靶标鉴定策略,建立结肠癌单细胞系HCT116X,并通过2-4周持续性加药处理HCT116X建立华蟾毒精耐药细胞;通过耐药程度测定和多药耐药排除筛选出华蟾毒精特异性耐药细胞;制备RNA样品并进行RNA-Seq;通过对RNA-Seq数据进行基因组比对、差异突变基因分析和突变频率分析获得耐药细胞的突变基因,即华蟾毒精的潜在靶标编码基因;利用靶标鉴定实验DARTS和CETSA验证华蟾毒精和潜在靶标的结合;通过差异表达基因分析和功能注释GO富集分析和KEGG Pathway分析发现华蟾毒精影响的功能和信号通路;通过免疫荧光实验观察华蟾毒精对微管结构的影响。【结果】华蟾毒精是蟾酥各活性成分中毒性最强的成分;本研究成功构建结肠癌细胞HCT116的单细胞系HCT116X,并测定了华蟾毒精对其的IC50为0.15μM;成功建立31个华蟾毒精耐药细胞;经过耐药性检测和多药耐药排除有13个华蟾毒精特异性耐药细胞;RNA-Seq数据表明平均每个样品测得16356个突变;差异突变基因分析得到194个差异突变基因;基因突变频率分析表明包括TRAK2、KATNB1在内的6个基因是突变频率最高的基因。DARTS和CETSA实验均表明华蟾毒精和TRAK2蛋白没有直接结合能力,而与KATNB1蛋白有直接结合能力;CETSA实验表明华蟾毒精和KATNB1（Val299Met）不直接结合。GO分析表明华蟾毒精处理使差异表达基因显著富集在纺锤体,中心体等结构和泛素以及降解等生物功能上。KEGG Pathway分析表明差异表达基因显著富集在核糖体等结构和代谢、衰老、降解等功能。免疫荧光实验显示华蟾毒精具有微管解聚作用。【结论】本研究利用Drug Target Seq策略发现了华蟾毒精在结肠癌细胞中的潜在分子靶标TRAK2和KATNB1,并证实了KATNB1蛋白与华蟾毒精在结肠癌细胞中的直接结合,最后在基因表达水平和细胞水平发现华蟾毒精对KATNB1的功能靶向调控作用。