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乙酰胆碱酯酶抑制剂(acetylcholinesterase inhibitors,AChEIs)通过抑制乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)的活性降低乙酰胆碱(acetylcholine,Ach)的水解速度,从而提高其在阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)患者脑内的含量,提高患者的认知功能,是目前临床上用于治疗AD最成功的药物之一。但是,AD是一种复杂的多因素疾病,AChEIs只能提高AD患者的认知功能,不能阻止神经元的退化。本研究从植物单体化合物和染料木素衍生物中筛选结构新颖、功能多样的AChEIs,并探讨了它们的作用机理和对神经细胞的保护作用。
利用Elleman方法从海南特产的稀有树种无翼坡垒(Hopea exalata)的次生代谢产物中筛选到了4个能够浓度依赖性地抑制AChE活性的多酚类化合物。其中,活性最好的化合物hopeahainol A抑制AChE的IC50值为4.33±0.17μM。该化合物是AChE的混合性抑制剂,推测该化合物能与AChE的PAS位点结合。
由于hopeahainol A是一个多酚类化合物,推测其具有抗氧化活性。实验证明,hopeahainol A可以缓解过氧化氢(H2O2)对PCI2细胞造成的氧化损伤。用200μM H2O2处理PCI2细胞引起细胞凋亡、细胞存活率降低、细胞内抗氧化相关的酶活性降低、细胞内丙二醛(MDA)含量升高、细胞中乳酸脱氢酶(LDH)外泄。0.1～10μM浓度的hopeahainol A可以浓度依赖性地缓解这些变化。另外,hopeahainol A还能缓解H2O2引起的细胞内活性氧(ROS)和Ca2+的升高,及其线粒体膜电位(MMP)的降低。这些结果说明hopeahainol A可以通过直接清除自由基或调节细胞中与抗氧化相关酶的活性而缓解H2O2对PCI2细胞造成的氧化损伤。因此,hopeahainol A是一个新型的具有抗氧化活性的多功能.AChEI,可望用于AD的预防与治疗。
雌激素可以预防AD的发生,改善AD的症状和延缓病情。但是,长期应用雌激素容易产生副作用,例如,增加乳腺癌和子宫内膜癌的发病率。雌激素的神经细胞保护作用是由Erβ受体介导的,而肿瘤的发生与Erα受体相关。染料木素(4’,5,7-三羟基异黄酮)是大豆异黄酮的主要生物活性物质。该化合物具有很强的雌激素活性,且对Erβ受体具有选择性,是替代雌激素治疗AD的理想化合物。本研究测试了一系列7-OH取代染料木素的AChE和丁酰胆碱酯酶(BuChE)抑制活性。15个化合物中有12个在100μM时对AChE的抑制率超过50％,而对BuChE没有抑制活性。活性最好的化合物14抑制AChE的IC50值为0.17±0.01μM,与阳性对照他克林相当。化合物14抑制AChE没有时间依赖性,是AChE的可逆性抑制剂。Linewear-Burk双倒数作图表明,该化合物是AChE的非竞争性抑制剂。计算机模拟化合物14与AChE的相互作用显示,该化合物通过与AChE的PAS位点结合而抑制AChE催化活性。因此推测化合物14具有抑制AChE诱导的Aβ聚合的作用。
E-screen显示,化合物14保持了染料木素的雌激素活性。在1μM浓度时对雌激素依赖性的乳腺癌细胞株MCF-7的生长具有最明显的促进作用,细胞数量为空白对照的136.7％,与阳性对照染料木素(细胞数量为空白对照的136.4％)相当。化合物14对MCF-7细胞的细胞毒性比其母体化合物染料木素强。两者的IC50值分别为23.7±1.0μM和82.2±0.2μM。计算机模拟化合物14与Erα和Erβ的相互作用显示,该化合物能与Erα和Erβ结合。化合物14与Erα和Erβ结合的解离常数分别为1.01μM和2.86 nM,对Erβ有很高的选择性。
体外实验证明,化合物14除了具有较强的AChE抑制活性外,对Aβ和H2O2诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用。15μM Aβ处理分化的SH-SY5Y细胞72 h,使大量的细胞凝聚成团,细胞数目减少。加入1000～0.1 nM化合物14预处理3 h,可以明显改善细胞形态,提高细胞存活率。MTT检测细胞存活率表明,15μM Aβ处理分化的SH-SY5Y细胞72 h后,细胞存活率下降为空白对照的75.6％。1000 nM,1nM和0.1 nM化合物14处理细胞都能明显提高细胞的存活率。其中1 nM浓度化合物14具有最强的细胞保护作用(细胞存活率94.2％),好于2 nM雌激素和相同浓度的母体化合物染料木素(细胞存活率分别为93.9％和85.5％)。15μM Aβ处理分化的SH-SY5Y细胞72 h使大量的细胞发生凋亡,1000 nM～0.01 nM浓度范围内的化合物14都可以降低Aβ引起的凋亡。其中,1 nM化合物14处理组的凋亡细胞的数量最少,1000 nM化合物14次之。MTT检测和hochest染色都证明,用200 nM雌激素受体拮抗剂ICIl72,780与SH-SY5Y细胞预孵1h,使1 nM化合物14,1 nM染料木素和2 nM雌激素对SH-SY5Y细胞的保护作用明显降低,而1000 nM化合物14对SH-SY5Y细胞的保护作用则不受ICI172,780的影响。推测化合物14在低浓度的时候通过雌激素受体途径保护神经细胞,在高浓度时通过抗氧化活性或抑制Aβ聚合的作用等非雌激素途径保护神经细胞。
300μM H2O2处理分化的SH-SY5Y细胞12 h后,细胞存活率下降为空白对照的43.1％。1000 nM～0.01 nM化合物14处理细胞都能明显提高细胞的存活率,且化合物14对SH-SY5Y细胞的保护作用呈倒“U”字型,1 nM化合物14对SH-SY5Y细胞的保护作用最强,1000 nM时对细胞的保护作用最低。推测在该模型中化合物14主要是通过雌激素途径保护细胞。因此,化合物14既具有很强的AChE抑制活性又具有抗雌激素活性和抗氧化活性,是一个多作用靶点的新型的AChEI。