论文部分内容阅读
氮素是植物生长、发育的必要元素,是植物的生命元素。植物可吸收利用的主要氮源是铵态氮和硝态氮。为适应外界不同氮素,植物进化出铵转运蛋白和硝酸盐转运蛋白对不同氮素进行分类吸收转运和氮代谢。我国蚕桑业的历史悠久。为了提高桑树的产量,桑树需要合理施用氮肥。但是,过量氮肥的施用,不仅不能被桑树吸收而造成浪费,还会引起环境污染。从分子生物学角度研究桑树氮代谢,为选育高效氮吸收的桑树新品种提供理论依据,有利于提高桑树对氮素的吸收效率,对桑树遗传育种工作具有一定的理论意义。本实验以鲁桑育71-1苗为材料,根据各物种的同源性分析比对后设计特异性引物,结合RT-PCR、RACE、软件拼接等技术获得这三个基因的包含完整开放阅读框的c DNA序列,并对其序列进行一系列生物信息学分析。运用不同氮素诱导处理与荧光定量PCR对克隆出的三个基因进行表达分析。主要研究内容如下:1.桑树高亲和铵转运蛋白AMT1基因的克隆、序列分析及表达分析从鲁桑育71-1品种克隆得到包含完整开放阅读框的Mm AMT1基因,其序列长度即为1518bp,编码505个氨基酸残基,属于铵转运蛋白家族(Ammonium Transporter Family)。经过生物信息学分析其与不同植物物种的同源性。在不同氮素条件,real-time PCR结果显示:在不同浓度KNO3处理条件下,Mm AMT1基因在低浓度、中浓度NO3-处理条件下的表达量均波动增加,而在高浓度NO3-处理条件下,Mm AMT1基因的表达量波动减少了;在不同浓度(NH4)2SO4处理条件下,Mm AMT1基因在低浓度NH4+条件下表达量提高,在中浓度和高浓度NH4+条件下,表达量降低;保持总氮量一定,不同氮源诱导下,Mm AMT1基因仅在NH4NO3的处理条件下表达量降低。2.桑树低亲和铵转运蛋白AMT2基因克隆、序列分析及表达分析从鲁桑育71-1品种克隆得到Mm AMT2基因(国家专利申请号:201610203308.5),获得完整的开放阅读框序列,其序列长度为1470bp,编码489个氨基酸残基,属于Ammonium Transporter Family。经过生物信息学分析其与不同植物物种的同源性。在不同氮素条件,real-time PCR结果显示Mm AMT2基因都会有不同程度的响应以及表达量的变化。在不同浓度KNO3处理条件下,Mm AMT2基因表达量变化的总体趋势是先增加,直到最大值,然后下降,且在低浓度NO3-处理条件下的响应度低于在中浓度和高浓度NO3-处理条件下的响应度;在不同浓度(NH4)2SO4处理条件下,Mm AMT2基因在低浓度NH4+条件下表达量提高,在中、高浓度NH4+条件下表达量呈波动降低;保持总氮量一定,不同氮源诱导下,Mm AMT2基因的表达仅在KNO3处理条件下升高。3.桑树硝酸盐转运蛋白NRT1基因的克隆、序列分析及表达分析从鲁桑育71-1品种克隆得到Mm NRT1基因(国家专利申请号:201610203634.6),其序列长度为1062bp,获得一个819bp的开放阅读框序列,编码272个氨基酸残基,属于MFS super family。经过生物信息学分析其与不同植物物种的同源性。在不同氮素条件,real-time PCR结果显示:在不同浓度KNO3处理条件下,Mm NRT1基因表达量变化的趋势均是先增加,然后下降。其响应度在低浓度NO3-处理条件下低于在中、高浓度NO3-处理条件下;在不同浓度(NH4)2SO4处理条件下,Mm NRT1在低浓度NH4+条件下表达量先升高后降低,变化不大。在中、高浓度NH4+条件下,Mm NRT1基因的表达量波动增加到最大值后,略微降低,总体表达量还是增加的。保持总氮量一定,不同氮源诱导显示,Mm NRT1基因在含有NH4NO3的处理条件下表达量升高,在KNO3与(NH4)2SO4诱导条件下表达量均降低。