慢性髓性白血病(CML)是一种起源于骨髓多能造血干细胞的恶性克隆增殖性疾病,由染色体易位而形成的Bcr-Abl融合基因及其编码的蛋白质是CML的发病基础,也是对白血病进行分子治疗的主要药靶。但是Bcr-Abl在疾病发生中的地位和作用机制还没有完全揭示,该疾病的发生是一个涉及多基因、复杂的信号通路网络的综合作用结果。为了找到更多有潜力的分子治疗药靶,我们利用RNA干扰(RNAi)技术和miRNA调控思路对CML的致病机理进行研究。以k562细胞作为CML研究的模型,确立了Bcr-Abl、Abl、Erk1、Gab2和Lyn为所要研究的基因。首先通过RT-PCR验证了它们的表达水平。然后设计并化学合成了能同时靶向Bcr-Abl和Abl基因的siRNA分子。通过脂质体法转染k562细胞,在此过程中调整转染参数,24或48小时后进行半定量RT-PCR分析,结果显示:Bcr-Abl和Abl基因完全下调后(100%),Erk1也完全下调(100%),Gab2的抑制率接近50%,而Lyn基因没有明显的抑制效果。当增加细胞数量时,这种抑制趋势相同,但呈现剂量依赖的方式。提示这些基因在转录(后)水平上具有相关性。多次实验的综合结果也显示,siRNA的设计和有效作用浓度是RNAi过程中两个关键的参数。将生物信息学手段和miRNA领域的研究理论相结合,来探索以上现象的潜在原因。利用EMBL数据库的ClustalW分析启动子区时发现Bcr-Abl、Gab2和Erk1,在转录起始位点上游2 kb左右的位置具有很好的同源性,同源区域大约250 bp左右,保守性为80%。而Lyn与它们三者的同源性差。进一步研究选取Gab2的269 bp保守区域进行研究,通过mfold折叠获得RNA结构图,发现-80～-150之间的一段区域具有明显的miRNA前体特征,30 nt的环,21和17 nt的臂。其中21 nt的臂在长度上符合成熟miRNA的要求,以该序列作为进一步研究对象,开展后续研究。合成寡聚核苷酸探针,用miRNA提取试剂盒来富集小片段的RNA。进行northern杂交工作。在此过程中摸索了探针标记、杂交、洗膜和成像过程,获得了miRNA前体的阳性条带。但要获得成熟miRNA的信息,并保证结果的稳定性,有必要进一步优化实验操作。为了研究这个潜在的miRNA的功能作用,构建与之相应的表达载体。合成两条能形成发卡结构的核苷酸序列,其中的臂与miRNA的序列相应。将单链DNA退火后,连入U6启动子驱动的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen表达载体,转化挑选菌落进行测序,确定阳性克隆。使用去内毒素的质粒提取试剂盒来提取质粒。瞬时转染K562细胞,因转染效率不能满足实验要求。有待于筛选阳性细胞克隆进行长期分析。在本篇论文中,我们以RNAi技术为平台,在转录或转录后水平上研究了功能相关基因的相互作用,确定了它们之间的一些联系。结合miRNA调控的思路来分析这些现象的原因,取得了初步的结果。为研究CML的发生和发展的分子机制和进一步开展基因治疗提供了新的思路。