芳香烃,尤其是多环芳烃（Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PAHs）对人和动物具有诱变致癌等作用,自然条件下难以被降解,含三个苯环及以上的高分子量多环芳烃更难被降解,对环境及人体的危害更大。比如芘,就是典型的含有四个苯环的多环芳烃,主要存在于煤焦油沥青的蒸馏物中,需要多种氧化酶才能逐步被降解,其中起到开环裂解的关键酶是邻苯二酚-2,3-双加氧酶（C23O）。研究者从不同微生物中克隆出邻苯二酚双加氧酶基因,并选择合适的宿主进行表达,以期提高对多环芳烃的降解效率。因此,本研究利用两种组成型启动子（S POI-II和P2）实现外源C23O基因的表达调控,以大肠杆菌作为宿主菌,初步探究工程菌的生长情况和芘降解情况,为今后高效降解芳香族化合物重组菌的构建提供新的思路。综上所述,本研究基于Over-lap PCR技术构建两株基因工程菌。主要结果如下:（1）构建PET-28a-T7+C23O表达载体,异源表达邻苯二酚-2,3-双加氧酶并探究酶学性质,结果表明:最适反应温度和pH值分别为30℃和7.0,金属离子中Mn²⁺对酶活有促进作用,其它Fe²⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺等金属离子对酶活均有抑制作用,其中Zn²⁺和Co²⁺对酶活的抑制作用较强;应用生物信息学软件预测C23O的二级结构和三级结构,结果表明:C23O是一种酸性亲水蛋白质,没有信号肽,由17.9%的α-螺旋,25.8%的β-折叠,56.3%的无规则卷曲等二级结构元件组成,含有Fe³⁺和HPX结合位点。（2）通过Over-lap PCR技术扩增出含两种启动子控制的邻苯二酚-2,3-双加氧酶基因,TA克隆连接至PMD-19T载体上,获得两个重组质粒PMD-19T-SPO I-II+C23O和PMD-19T-P2+C23O,转化E.coil Bl21得到两株基因工程菌;经S DS-PAGE检测,蛋白表达结果表明:两株工程菌均可正常表达目的蛋白,大小在44.3 kDa左右,说明工程菌构建成功。（3）运用稀释平板计数法测定两株工程菌在芘培养基中的生长曲线,结果表明:芘无机盐培养基中单独加入工程菌时,SPOI-II-C23O和P2-C23O工程菌第三天的菌数都为零,当同时添加芘降解野生型菌XJ-6后工程菌可以生长,在第五天时菌数达到最高分别为38×10⁶ CFU和35×10⁶ CFU;应用HPLC测定各实验组对芘的降解率,结果表明:7 d后XJ-6、XJ-6+SPOI-II-C23O和XJ-6+P2-C23O对芘的降解率分别为35.76%、12.37%和12.3%;添加葡萄糖会提高各实验组中工程菌的菌数及对芘的降解率。室内模拟修复实验结果表明:土壤中单独加入工程菌时,SPOI-II-C23O和P2-C23O可以生长,42 d时的生长量最高分别为55×10⁴ CFU和68×10⁴ CFU;应用荧光分光光度计测定各实验组对芘的降解率,结果表明:48 d后XJ-6、XJ-6+SPOI-II-C23O和XJ-6+P2-C23O对芘的降解率分别为21.6%、25.12%和26.4%。