“脾主肌肉”是指脾脏通过运化水谷充养肌肉,以保证肌肉丰厚,运动正常。当脾运化不及时,肌肉失于濡养就会导致肌肉萎缩、身重无力、肌肉疼痛痉挛等一系列病变。现代研究表明,“脾主肌肉”在病理状态下与肌肉减少症、重症肌无力等肌肉功能减退类疾病关系密切,此类疾病机制涉及糖代谢紊乱、炎症、线粒体损伤等多个方面。本文拟从糖代谢及炎症角度,探究脾虚肌肉损伤的分子机制,同时基于中医“方证相关”理论,探查补中益气汤对脾虚模型炎症反应及糖代谢的作用及其分子机制。研究一:脾虚模型大鼠骨骼肌损伤的分子机制方法:大鼠随机分为正常组、模型组各18只,模型组用“饮食失节+游泳劳倦”法造模,对照组正常饲养。在实验第14、21、28d,各组大鼠灌服D-木糖溶液后收集尿液;实验第15d、22d、29d,麻醉处杀各组大鼠,取血、脾脏、胸腺及双侧腓肠肌。观测指标:(1)行为学:外观表征和体重、粪便含水率、饮食量、强迫负重游泳实间、抓握力;(2)脾脏和胸腺指数、肌湿重、湿重/体重;(3)实验室指标:1)血清:胃泌素(GAS)、胃动素(MTL)、白介素-1(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α);2)尿液:尿D-木糖排泄率;3)骨骼肌:柠檬酸合酶(CS)、Ca2+-ATPase、肌糖原、肿瘤坏死因子受体相关蛋白6(TRAF6)、IL-1β、IL-6、TNF-α、糖原合成酶激酶-3(pGSK-3β)、己糖激酶-2(HK-2)、葡萄糖转运蛋白-4(GLUT4),光镜下观察肌组织病理变化。结果:(1)脾虚证候指标:1)一般体征及体重:与正常组相比,模型组皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分在2-4周明显升高(P<0.01),体重在1-4周明显降低(P<0.01);2)饮食量及粪便含水率:与正常组相比,模型组1-4周饮食量明显下降(P<0.01),粪便含水率在2-4周明显升高(P<0.05或P<0.01);3)免疫器官指数:与正常组相比,模型组脾脏、胸腺指数第4周均显著下降(P<0.05或P<0.01);4)实验室指标:与正常组相比,模型组血清GAS、MTL在第4周明显下降(P<0.01),D-木糖排泄率在2-4周显著减少(P<0.01)。(2)骨骼肌指标:1)肌肉功能形态:与正常组相比,模型组游泳力竭时间及抓握力在3-4周明显下降(P<0.01),肌湿重及湿重/体重也在第4周明显下降(P<0.01);镜下观察到:对照组2-4周肌纤维整齐,无充血和炎性细胞浸润;模型组第3-4周出现肌纤维紊乱,伴有间质充血和炎性细胞浸润;2)肌肉生化:与正常组相比,模型组第4周CS、Ca2+-ATP、肌糖原均明显下降;3)肌肉分子指标:与正常组相比,模型组TRAF6、IL-1 β、IL-6、TNF-Ⅱ在第4周明显上升(P<0.05或P<0.01),pGSK-3 β在3-4周明显上升,HK-2第4周明显上升,GLUT4第4周显著下降(P<0.01)。(3)血清指标:与正常组相比,模型组第2周IL-6、TNF-α明显升高,第 4 周 IL-1β、TNF-α 则明显下降(P<0.05 或 P<0.01)。结论:“饮食失节+游泳疲劳”法复制的脾虚大鼠模型随着造模时间延长逐渐表现出与脾虚证候相符的外观行为、脏器指数及实验室指标变化,并出现肌力减退和肌组织损伤。模型逐渐出现明显的线粒体损伤及能量供应不足,血清炎性因子水平呈先升后降趋势,而肌肉炎性因子则在3-4周明显升高,且第4周时模型出现骨骼肌葡萄糖转运及糖原合成减少。提示脾虚状态下机体免疫功能下降并伴有肌肉局部炎性损伤,脾虚骨骼肌损伤机制不仅涉及炎症反应,还与能量代谢异常及糖代谢障碍有关。研究二:补中益气汤对脾虚大鼠肌肉功能的改善作用及机制方法:大鼠随机分为正常组、模型组和大、小剂量组各10只。对照组正常饲养,模型组和给药组按上述方法造模4周,高、低剂量组从第3周起每日按5.85g/kg和17.55g/kg予补中益气汤灌胃,日1次,连续14d。实验第28d时所有大鼠灌服D-木糖溶液并收集尿液,第29d麻醉处杀所有大鼠,取血、脾脏、胸腺及双侧腓肠肌。观测指标:(1)行为学:外观表征和体重、粪便含水率、饮食量、强迫负重游泳实验、抓握力;(2)脾脏和胸腺指数、肌湿重、湿重/体重(3)实验室指标:1)血清:GAS、MTL、IL-1β、IL-6、TNF-α;2)尿液:尿D-木糖排泄率;3)骨骼肌:CS、Ca2+-ATPase、肌糖原、半胱氨酸蛋白酶-3(Cleaved-caspase3)、TRAF6、p65、p-p65、IL-1 β、IL-6、TNF-α、肌肉素(MUSCLIN)、瘦素(Leptin)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、PI3K、Akt、pAkt、pGSK-3 β、HK-2、GLUT4,于光镜、电镜下观察肌组织病理变化。结果:(1)脾虚证候指标:1)一般体征及体重:与正常组相比,模型组皮肤毛发、行为状态、活跃程度、睡眠状态积分2-4周明显升高,体重1-4周明显降低(P<0.01);与模型组相比,大剂量组第4周上述积分均明显下降,体重显著增加(P<0.05或P<0.01);2)饮食量及粪便含水率:与正常组相比,模型组2-4周饮食量、粪便含水率均明显降低(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,大、小剂量组第4周粪便含水率明显上升,且大剂量组饮食量明显下降(P<0.01);3)游泳力竭时间:与正常组相比,模型组游泳力竭时间明显下降(P<0.01);与模型组相比,大、小剂量组游泳力竭时间显著提升(P<0.01);4)脏器指数:与对照组相比,模型组脾脏、胸腺指数均明显下降(P<0.01);与模型组相比,大剂量组脾脏、胸腺指数均明显提升(P<0.05或P<0.01);5)实验室指标:与对照组相比,模型组血清GAS、MTL、尿D-木糖排泄率明显下降(P<0.01);与模型组相比,大、小剂量组GAS、MTL、尿D-木糖排泄率均明显提升(P<0.05或P<0.01)。(2)骨骼肌指标:1)肌肉功能形态:与正常组相比,模型组抓握力、肌湿重、湿重/体重明显下降(P<0.01);与模型组相比,小剂量组肌湿重、湿重/体重明显提升,大剂量组抓握力、肌湿重、湿重/体重均明显上升(P<0.05或P<0.01);镜下显示,正常组肌纤维整齐,无充血及炎性细胞浸润,线粒体结构完整,模型组肌纤维紊乱,充血及炎性细胞浸润严重,线粒体受损严重,大、小剂量组肌组织和线粒体结构均明显改善;2)肌肉生化:与正常组相比,模型组CS、Ca2+-ATP、肌糖原明显下降,cleaved-caspase3显著增加(P<0.01);与模型组相比,大、小剂量组CS、Ca2+-ATP、肌糖原显著性提升,cleaved-caspase3明显下降(P<0.05或P<0.01);3)肌肉分子指标:糖代谢通路方面,与正常组相比,模型组PI3K、Akt、pAkt明显下降(P<0.01);与模型组相比,两剂量组PI3K、Akt、pAkt显著增加(P<0.05或P<0.01)。在PI3K/Akt通路上游,与对照组相比,模型组Leptin、IGF-1明显下降(P<0.01),MUSCLIN显著上升(P<0.01);与模型组相比,小剂量组MUSCLIN显著下降,大剂量组Leptin和IGF-1明显上升,MUSCLIN明显下降(P<0.05或P<0.01)。在PI3K/Akt通路下游,与对照组相比,模型组pGSK-3β、HK-2明显增加,GLTU4显著下降(P<0.01)。与模型组相比,两剂量组pGSK-3 β、HK-2明显下降,且大剂量组GLUT4显著上升(P<0.05)。炎性通路方面,与对照组相比,模型组TRAF6、p65和p-p65均明显上升(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,两剂量组p-p65显著减少,且大剂量组TRAF6显著下降(P<0.05或P<0.01)。关于炎性因子,与对照组相比,模型组IL-1β、IL-6、TNF-α明显上升(P<0.05或P<0.01);与模型组相比,两剂量组IL-6、TNF-α均显著下降,且大剂量组IL-1 β显著降低(P<0.01)。(3)血清指标:与对照组相比,模型组IL-1β、TNF-α明显下降(P<0.01),IL-6显著上升(P<0.05);与模型组相比,两剂量组IL-6显著下降,且大剂量组IL-1β、TNF-α明显提升(P<0.05或P<0.01)。结论:脾虚大鼠肌力减退和肌萎缩与炎性损伤、糖代谢紊乱等机制密切相关,其中炎性机制涉及TRAF6/NF-kB通路的激活,糖代谢紊乱则与PI3K/Akt通路抑制密切关联。补中益气汤在改善脾虚证的同时,对模型大鼠肌肉功能减退和病理损伤均有良好的改善作用,其机制:(1)抑制TRAF6/NF-kB通路,减少炎性因子释放,保护肌细胞及线粒体结构;(2)调节LEPTIN、MUSCLIN、IGF-1含量,恢复PI3K/Akt通路正常激活,促进肌肉葡萄糖转运和肌糖原合成,以改善骨骼肌功能。本研究从炎症、糖代谢角度为中医“脾主肌肉”提供了现代病生理学机制层面的解释,部分揭示了补中益气汤健脾强肌作用机制,为其临床运用提供了一定分子药理学依据。