本研究从表观-消化-代谢三个层面系统研究了饲喂秸秆饲料奶牛泌乳性能低下的营养代谢机理。首先通过饲养试验,检测玉米秸秆或稻草替代苜蓿后奶牛泌乳性能的变化；进而研究消化道内关键乳成分前体物生成与上皮功能,以揭示秸秆替代苜蓿后在消化层面所产生的差异；最后从代谢层面揭示秸秆替代苜蓿后氨基酸、葡萄糖等关键物质的代谢及其通路。1.秸秆替代苜蓿对奶牛生产性能的影响本部分研究了玉米秸秆或者稻草替代苜蓿后对奶牛泌乳性能及营养物质消化率的影响。选择45头处于泌乳中期的经产健康荷斯坦奶牛(体重=607±55.6kg,DIM=164±24.8 d,奶产量=29.7±4.7 kg/d；胎次=3.4±1.45；均值±SD),完全随机区组等分成3组进行试验。试验日粮等氮且精粗比为55：45(DM),精料相同,青贮玉米都为15%,主要区别为粗饲料(DM)：(1)23%苜蓿干草+7%羊草(AH)；(2)30%玉米秸秆(CS)；(3)30%稻草(RS),试验持续14周,2周为适应期,12周为采样期。结果发现,各处理之组间干物质采食量差异均不显著,但DM、粗蛋白、纤维物质表观消化率都以CS和RS显著低于AH,奶产量,乳蛋白、乳脂、乳糖及总固形物产量是CS组和RS组显著低于AH组,但CS组和RS组之间无显著差异。乳蛋白含量和乳总固形物含量RS组显著低于AH组,CS组与其他两组相比都无显著差异。饲料利用率秸秆日粮显著低于AH组。2.秸秆替代首蓿对奶牛消化道内乳成分前体物生成与吸收的影响本部分分析了上述饲养试验中奶牛小肠可代谢蛋白质产量以及瘤胃发酵参数(45头奶牛)；并在饲养试验结束后,各组选取6头奶牛计18头用于屠宰试验,以分析消化道乳蛋白前体物的AA组成以及瘤胃上皮形态与功能。2.1小肠可代谢蛋白质与瘤胃发酵参数饲喂RS和CS组奶牛的瘤胃微生物蛋白质(MCP)产量以及过瘤胃蛋白(RUP)量都显著低于AH组,因此作为乳蛋白前体物的小肠可代谢蛋白质也低。进一步分析发现,秸秆日粮可发酵碳水化合物低于AH组,可能引起了可利用能不足,导致秸秆日粮MCP低下的主要原因。各组奶牛瘤胃液pH值无显著差异,且都在正常范围内；RS组瘤胃液中氨态氮浓度显著高于AH组和CS组,总挥发性脂肪酸浓度RS组和CS组显著高于AH组,秸秆组间无显著差异,这与秸秆日粮能量含量以及消化率一致。2.2消化道内乳蛋白前体物氨基酸组成以瘤胃降解16h后的残存的饲料蛋白作为RUP,分析粗饲料及日粮(TMR) RUP的AA组成,发现AA的瘤胃降解率不同粗饲料间差异较大,而不同TMR间则无显著差异；RUP的AA组成不同粗饲料间差异较大,但不同TMR间较为相近,表明粗饲料与精饲料的AA在瘤胃降解过程中发生了某些交互作用。分析MCP的AA组成发现,各日粮间除Arg外都无显著差异。比较MCP、瘤胃液以及瘤胃总食糜AA的组成,发现大部分AA所占比例在各组分间显著差异,其中必需AA(EAA)在瘤胃食糜中最高,瘤胃微生物中次之,瘤胃液中最低。瘤胃液游离AA与日粮AA组成呈线性相关。瘤胃、瓣胃、十二指肠和空肠间总食糜AA组成差异显著,但日粮处理间大部分AA都无显著差异。以上结果表明瘤胃微生物的AA组成较为稳定,且瘤胃微生物更倾向于利用EAA。2.3瘤胃上皮形态变化与吸收功能RS日粮主要表现为饲料颗粒长度大于CS和AH组。对瘤胃上皮进行形态学检测分析,发现RS组奶牛瘤胃乳头的厚度高于AH组和CS组。经过RNA-seq方法检测并经AH对CS、AH对RS和CS对RS两两比较,分别发现37、47和30个差异基因。生物过程功能分类与基因注释分类分析结果,发现了在不同日粮颗粒下离子结合(如DSG1)、增殖与凋亡过程(如BAG3)以及包括细胞外基质蛋白的细胞生长调控功能(比CYR61)等相关基因的动态变化,提示不同颗粒大小与营养水平日粮对瘤胃上皮形态的影响,在分子层面表现为影响离子结合、细胞生长以及细胞增殖与分化等主要功能。3.秸秆替代苜蓿对奶牛营养生理代谢的影响本部分分析了奶牛的氮与氨基酸代谢、葡萄糖代谢以及血液代谢组学。各组选取10头奶牛计30头,在第6周和第10周连续3天采集日粮、粪尿、牛奶等样品进行氮平衡试验；在第12周的第5、第6天,每隔6h取乳腺动静脉血液样,制取血浆样用于分析。3.1氮代谢与氨基酸代谢和利用反映了氮的消化率,粪氮排泄量及其占采食N比例为CS组和RS组显著高于AH组奶牛；尿氮排泄量与比例RS组显著高于AH组和CS组,血中尿素氮含量以RS组奶牛显著高于AH组。NRC模型预测小肠可消化AA流量,CS组和RS组显著低于AH组,RS组奶牛动脉血Met和Val显著低于AH组。乳腺血流量秸秆显著低于AH组,但CS组与RS组间无显著差异。乳腺对大部分EAA的摄取量,CS组和RS组显著低于AH组,特别是支链AA, Arg和Met。RS组奶牛Met的乳腺摄取量与牛奶中排出量比显著低于AH组且值小于1。结果提示,动脉血液AA供应不足以及乳腺血流量低下是限制秸秆组奶牛乳腺对AA摄取并用来合成乳蛋白的关键因素。3.2葡萄糖代谢与利用作为血糖前体物的瘤胃丙酸浓度,RS组显著低于AH组；反映肝脏糖原异生作用的丙酮酸羧激酶mRNA丰度以RS组显著低于AH组和CS组,线粒体磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶、胰岛素样生长因子1受体、磷酸果糖激酶(肝源、肌源及胰源)等酶的mRNA丰度RS组显著低于AH组。奶牛乳腺对葡萄糖的摄取量CS组和RS组显著低于AH组；乳中K+浓度RS组显著高于AH组和CS组。这些结果显示,饲喂稻草日粮奶牛丙酸生产较低,引起肝脏糖异生作用合成葡萄糖较少,供应于乳腺的葡萄糖摄取量低下,最终导致乳糖合成不足。3.3乳腺动静脉血液代谢组学以晨饲前的动静脉血浆进行代谢组分析,用多元偏最小二乘判别分析用于鉴定配对比较数据。动静脉血浆中总共鉴定出237个代谢物,比较动静脉血发现有31个显著差异代谢物,动脉血浆中含有较高浓度的AA和葡萄糖,β-羟丁酸、Glu、 Met、Phe、葡萄糖、甲基丙氨酸和Tyr是泌乳过程中的关键差异代谢物。研究不同日粮处理下的动脉和静脉血液代谢组结果发现,秸秆日粮与AH组的主要差异为动脉代谢组,且主要区别为氮代谢(Phe、Tyr和Trp生物合成通路,Phe代谢)和能量代谢(TCA循环),提示动脉血液在研究乳腺营养代谢中的关键作用。分析发现,Phenylpropanoate分别是RS组和CS组区别于AH组的关键差异代谢物,另外Prostaglandin A是RS组特有代谢物。饲喂秸秆日粮的奶牛动脉血浆中主要升高了激素、脂类物质和碳水化合物等物质,而有机酸及AA类代谢物相对含量降低,由此推测,与AH组相比,两个秸秆日粮特别是RS组营养物质与能量供应相对不足,影响了奶牛机体稳态,这可能是造成秸秆组奶牛生产水平较低的重要原因。综上所述,玉米秸秆或稻草日粮饲喂泌乳奶牛,与苜蓿日粮相比奶产量、乳蛋白产量和饲料利用效率显著低下。在消化层面分析,秸秆日粮瘤胃总挥发性脂肪酸和微生物蛋白产量、日粮RUP以及小肠AA流量少于苜蓿日粮,乳蛋白前体物的AA组也表现出一定差异。在代谢层面,饲喂秸秆日粮奶牛乳腺血流量较少,且RS日粮肝脏糖异生葡萄糖较少,导致乳腺AA和葡萄糖供给量和摄取量低于苜蓿日粮,限制了奶牛泌乳。动静脉代谢组学分析发现,秸秆日粮与苜蓿日粮的主要差异为动脉代谢组,且主要区别为氮代谢与能量代谢通路。本研究系统揭示了饲喂秸秆饲料奶牛泌乳性能低下的营养代谢机理,为秸秆资源的有效利用提供了重要的基础资料。