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目的双酚A（Bisphenol A,BPA）作为合成聚碳酸酯和环氧树脂的原料,被广泛应用于塑料制品和涂层等生产领域,可通过消化道、呼吸道及皮肤等接触途径进入人体。研究表明,BPA暴露可导致类固醇激素水平紊乱、卵巢和子宫组织病理学损伤,从而诱导雌性生殖功能障碍,最终导致生育能力降低,甚至不孕症的发生。胚胎期和胎儿期是人类生殖发育的关键时期,且BPA可通过胎盘屏障,因此孕期BPA暴露可能对子代生殖功能产生严重不良影响。目前研究已证实,孕期BPA暴露可引起子代神经发育障碍、内分泌功能紊乱、雄性生殖功能异常等变化,但对雌性子代生殖系统损伤的研究较为少见,具体机制尚不明确。表观遗传学调控已被证实是BPA生殖毒性的重要机制之一。此外,Wnt/β-catenin信号通路在胚胎发育过程中发挥重要作用。因此,本实验研究了孕期BPA暴露对不同发育阶段仔鼠卵巢生殖功能的影响,并进一步探究其对卵巢组织Wnt/β-catenin信号通路及其DNA甲基化调控机制,以期为BPA相关生殖疾病的防治和早期干预提供理论基础。方法1.SPF级健康SD雌性大鼠30只,雄性大鼠15只,10周龄。以雌雄2:1比例进行合笼,于次日清晨进行阴道涂片检查,以在显微镜下观察到精子的日期为怀孕0天（Gestation day 0,GD 0）。将受孕成功的30只母鼠随机分为5组,每组6只,于GD 5进行灌胃染毒,以5 ml/kg容积灌胃染毒至GD 19,1次/天,染毒剂量为0（对照组）、0.05、0.5、5、50 mg/kg/d,母鼠自然分娩、哺乳后,分别在断乳期出生后第21天（Postnatal day,PND 21）和性成熟期第56天（PND56）处死雌性仔鼠,进行生物样本的采集及相关指标的检测。2.观察PND 21天和PND 56天雌性仔鼠的一般发育情况。3.通过HE染色观察BPA对卵巢组织结构的损伤情况。4.采用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测PND 56天雌性仔鼠血清中孕酮（Progesterone,P）以及雌二醇（Estradiol,E2）的含量。5.采用RT-PCR测定PND 21和PND 56天雌性仔鼠卵巢组织中细胞色素P450侧链裂解酶（Cytochrome P450Scc,CYP11A1）、17α-羟化酶（Cytochrome P450c17,CYP17A1）、细胞色素P450芳香化酶（Cytochrome P450arom,CYP19A1）编码基因以及雌激素受体（Estrogen Receptor,ER）ERα（Esr1）、ERβ（Esr2）m RNA的表达水平。6.采用RT-PCR、Western blotting检测雌性仔鼠卵巢组织中DNA甲基化转移酶（DNA methyltransferase,Dnmt）DNMT1、DNMT3a、DNMT3b和Wnt/β-catenin信号通路中的WNT家族重要成员Wnt4（Wingless-type MMTV intergration site family member 4,Wnt4）、β-连环蛋白（beta-catenin,β-catenin）及其编码基因（Ctnnb1）的表达水平。7.利用甲基化特异性PCR（Methylation-specific PCR,MSP）法检测通路上游负调控因子分泌型蛋白（Dickkopf-1,DKK1）编码基因启动子区DNA甲基化水平。RT-PCR检测Dkk1基因的m RNA表达水平。结果1.孕期BPA暴露对PND 21雌性仔鼠卵巢功能及Wnt/β-catenin信号通路调控机制的影响（1）雌性仔鼠一般毒性结果:雌性仔鼠的体重在0.05 mg/kg组显著上升,（P＜0.05）。肛殖距（Anogenital distance,AGD）在50 mg/kg组显著缩小（P＜0.05）。卵巢湿重在50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）,但卵巢脏器系数差异无统计学差异（P＞0.05）。子宫和卵巢湿重和脏器系数均在5 mg/kg组显著升高（P＜0.05）。（2）卵巢组织HE染色结果可见,对照组仔鼠卵巢内有中等大小的卵泡,包括初级卵泡、次级卵泡。孕期BPA暴露后,仔鼠卵巢内卵泡数量增加,空腔变大,但结构模糊。50 mg/kg组能明显看到卵巢结构损伤。（3）仔鼠卵巢组织类固醇激素合成酶及雌激素受体m RNA表达的检测结果显示,与对照组比较,Cyp11a1和Cyp17a1 m RNA表达水平在0.05、5和50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。Cyp19a1 m RNA表达水平与对照组相比没有显著差异（P＞0.05）。ERα（Esr1）m RNA水平在0.05 mg/kg组显著升高,在5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。ERβ（Esr2）m RNA水平在50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。（4）仔鼠卵巢组织DNA甲基转移酶及蛋白表达水平检测发现,与对照组比较,Dnmt1 m RNA表达水平在各剂量组无明显变化（P＞0.05）;DNMT1蛋白在0.5、5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。Dnmt3a和Dnmt3b m RNA相对表达水平在0.05、5、50 mg/kg组显著升高（P＜0.05）;DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达水平与对照组相比均无明显差异（P＞0.05）。（5）仔鼠卵巢组织中Wnt4 m RNA表达水平在5和50 mg/kg组均显著下降（P＜0.05）;WNT4蛋白表达量在0.5、5和50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。β-catenin（Ctnnb1）m RNA表达水平在0.05 mg/kg组显著升高,在5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）;β-catenin蛋白表达量在0.5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。（6）仔鼠卵巢组织Dkk1基因启动子区的甲基化结果显示,各剂量组与对照组相比没有明显差别,说明未发生甲基化水平的改变（P＞0.05）。Dkk1 m RNA表达水平在0.5、5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。2.孕期BPA暴露对PND 56雌性仔鼠卵巢功能及Wnt/β-catenin信号通路调控机制的影响（1）雌性仔鼠一般毒性结果:阴道开口日龄在0.5 mg/kg延迟,在50 mg/kg组提前。阴道开口日体重在0.5、5 mg/kg组下降（P＜0.05）。体重、卵巢湿重和卵巢脏器系数均无明显变化（P＞0.05）。子宫湿重和子宫脏器系数在50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。（2）卵巢组织HE染色结果可见,对照组卵巢内可见初级卵泡、各次级卵泡和黄体,各级卵泡界限清晰。BPA暴露后,卵巢发生萎缩,原始卵泡数量变少,黄体相对较少。（3）仔鼠血清中P和E2检测结果显示,与对照组相比,孕期BPA暴露对子代雌性大鼠血清P水平变化没有显著影响（P＞0.05）;E2水平随BPA剂量呈下降趋势,且在0.5、5、50 mg/kg组有统计学意义（P＜0.05）。（4）仔鼠卵巢组织类固醇激素合成酶及雌激素受体m RNA表达的检测结果显示,与对照组比,卵巢组织中Cyp11a1 m RNA表达在0.05 mg/kg组显著升高（P＜0.05）。在0.05、50 mg/kg组Cyp17a1 m RNA表达与对照组相比显著升高（P＜0.05）。Cyp19a1 m RNA表达差异没有统计学意义（P＞0.05）。ERα（Esr1）m RNA水平在50 mg/kg组显著升高（P＜0.05）;ERβ（Esr2）m RNA水平在5、50mg/kg组显著升高（P＜0.05）。（5）仔鼠卵巢组织DNA甲基转移酶基因及蛋白表达水平检测发现,与对照组比较,Dnmt1 m RNA表达水平在5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）;DNMT1蛋白水平在0.5、5、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。Dnmt3a基因及其蛋白表达水平均在50 mg/kg组显著升高（P＜0.05）。Dnmt3b m RNA表达水平在5 mg/kg组显著下降（P＜0.05）;DNMT3b的蛋白表达水平在0.05、50 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。（6）仔鼠卵巢组织中Wnt4 m RNA和蛋白表达水平均在50 mg/kg组显著升高（P＜0.05）。β-catenin（Ctnnb1）m RNA表达水平在0.5、5和50 mg/kg组显著升高（P＜0.05）;β-catenin蛋白水平在0.5、50 mg/kg组显著升高（P＜0.05）。（7）仔鼠卵巢组织Dkk1基因启动子区甲基化结果显示,在0.05、0.5、5、50 mg/kg组甲基化水平均升高（P＜0.05）。Dkk1 m RNA表达水平在0.05、0.5和5 mg/kg组显著下降（P＜0.05）。结论1.孕期BPA暴露可导致雌性仔鼠血清E2水平下降,类固醇激素合成酶和雌激素受体表达紊乱,卵巢组织病理学损伤,从而导致青春期发育异常及生殖功能损伤。2.孕期BPA暴露可导致雌性仔鼠卵巢组织DNA甲基转移酶表达变化,从而影响基因的甲基化水平。3.孕期BPA暴露可通过Dkk1基因启动子区高甲基化,下调Dkk1 m RNA表达,激活Wnt/β-catenin信号通路,对子代卵巢发育产生影响。但这一机制在PND21天的仔鼠卵巢组织中尚不明显,其具体机制还需进一步研究。