双酚A诱导猪卵母细胞内质网应激的研究

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双酚A(Bisphenol A,BPA)是一种内环境分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals,EDCs),具有弱雌激素作用。有研究证明,BPA进入动物机体后会通过干扰天然雌激素的合成、分泌与代谢对动物生殖系统造成负面影响。目前关于BPA的研究主要针对其对雄性生殖系统的损伤和对雌性妊娠期胚胎发育的影响,而关于低剂量BPA对生殖细胞成熟与发育影响的研究十分稀少。本研究通过在猪卵母细胞成熟培养液中添加BPA研究了BPA损伤猪卵母细胞成熟与发育能力的机制;BPA对猪卵母细胞成熟阶段和胚胎发育阶段内质网应激相关基因和凋亡相关基因表达水平的影响;BPA对卵丘细胞扩展的影响;BPA对卵丘细胞内质网应激相关基因和凋亡相关基因表达水平的影响。本研究对于降低内环境分泌干扰物对动物的影响、提高优良家畜卵子利用效率以及完善猪卵母细胞体外成熟体系具有重要理论和实践指导意义。试验一研究不同浓度内质网应激抑制剂牛磺熊脱氧胆酸(Taurine ursodeoxycholic acid,TUDCA)对卵母细胞体外成熟和发育的影响,确定猪卵母细胞成熟培养中TUDCA的最佳浓度。挑选出卵丘包裹良好的猪卵丘卵母复合体(Cumulus oocyte complex,COCs),在CO2培养箱中39℃培养42 h,统计卵母细胞存活率和第一极体排出率,观察卵丘细胞的扩展情况,计算卵丘扩展指数(Cumulus Expansion Index,CEI)。试验分为四组,对照组:不添加TUDCA。50μM组:在体外成熟培养液中添加TUDCA使工作浓度为50μM。100μM组:在体外成熟培养液中添加TUDCA使工作浓度为100μM。150μM组:在体外成熟培养液中添加TUDCA使工作浓度为150μM。结果显示,在卵母细胞成熟培养液中添加TUDCA能提高卵母细胞的第一极体排出率,后续的孤雌胚胎培养结果也显示TUDCA能提高卵母细胞的发育潜力,其中100μM组效果最佳。TUDCA能够促进卵丘扩展,在50μM~150μM范围内,CEI随TUDCA浓度的升高而升高。试验二研究BPA诱导猪卵母细胞内质网应激损伤猪卵母细胞成熟与发育能力的机制。试验分为三组,对照组:不添加BPA与TUDCA。BPA组:使用浓度为50μM的BPA处理卵母细胞。BPA+TUDCA组:使用浓度为50μM的BPA和100μM的TUDCA共同处理卵母细胞。在卵母细胞成熟后,观察卵母细胞成熟质量,测定卵母细胞存活率和第一极体排出率;采集卵母细胞进活性氧(Reactive oxygen species,ROS)染色和线粒体染色,分析活性氧染色荧光强度,测定线粒体分布均匀性;采集卵母细胞测定内质网应激标志基因(GRP78、ATF4、CHOP)和凋亡相关基因(Bcl-2、Bax、Caspase-3)相对表达量。观察各组卵丘细胞的扩展情况并计算CEI;收集卵丘细胞检测内质网应激及凋亡相关基因(GRP78、ATF4、CHOP、Bcl-2、Bax、Caspase-3)表达情况,检测卵丘扩展相关基因(Ptgs1、Ptgs2、Ptx3)表达情况。结果显示,添加BPA显著降低了卵母细胞成熟时的存活率,但对极体率影响不显著;BPA显著降低了孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数;BPA显著提高了卵母细胞ROS含量,降低了线粒体均匀分布比例,阻碍了卵母细胞胞质成熟;BPA显著上调卵母细胞内质网应激相关基因(GRP78、ATF4、CHOP)和凋亡相关基因的表达(Bax、Caspase-3)的表达,而凋亡抑制基因Bcl-2的表达则发生下调;BPA阻碍了卵丘细胞扩展,显著降低了CEI;BPA显著上调卵丘细胞内质网应激相关基因(GRP78、ATF4、CHOP)和凋亡相关基因的表达(Bax、Caspase-3)的表达,下调凋亡抑制基因Bcl-2的表达,下调了卵丘扩展相关基因(Ptgs1、Ptgs2、Ptx3)的表达。添加TUDCA能够有效缓解BPA的负面影响,相较于BPA组,TUDCA与BPA共处理能显著提高卵母细胞的成熟时的存活率及后续孤雌胚胎的卵裂率、囊胚率以及囊胚总细胞数;显著降低卵母细胞ROS含量,提高线粒体均匀分布比例;降低卵母细胞内质网应激标志基因和凋亡基因的表达水平,提高凋亡抑制基因Bcl-2的表达水平;下调卵丘内质网应激相关基因和凋亡相关基因的表达,凋亡抑制基因Bcl-2的表达升高,与卵丘扩展相关基因的表达显著升高。综上所述,BPA能够诱导卵丘细胞和卵母细胞产生内质网应激致使细胞凋亡水平升高。卵母细胞内ROS含量上升、线粒体均匀分布比例下降、囊胚总细胞数减少、抑制卵丘细胞扩展。最终导致卵母细胞的成熟质量及发育潜力受损。
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