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目的:运用iTRAQ-MS定量技术对受试者血清进行差异蛋白质组学研究,筛选HIV/AIDS湿热内蕴证与健康对照组的差异表达蛋白,并用ELISA实验技术对差异表达蛋白进行验证,最后对差异表达蛋白进行生物信息学分析,探讨差异表达蛋白的功能及相互作用关系,寻找HIV/AIDS湿热内蕴证的蛋白质物质基础。方法:1根据HIV/AIDS湿热内蕴证诊断量表筛选病例,同地区的健康人作为对照,抽取受试者清晨空腹血液,离心处理后取上层血清作为样本。2采用聚丙稀铣胺凝胶电泳(SDS-PAGE)对血清高丰度蛋白去除效果进行评价。3运用iTRAQ技术对低丰度蛋白进行标记。4运用MS技术对血清中的低丰度蛋白进行鉴定和定量分析,运用软件Mascot 2.2和Proteome Discoverer 1.4(thermo)对质谱分析所得的原始数据进行查库鉴定及定量分析,筛选出HIV/AIDS湿热内蕴证差异表达蛋白。5运用ELISA实验技术验证筛选出的特异性差异表达蛋白在湿热内蕴证和健康对照组中的表达,分析变异倍数和P value值。6运用基因本体(Gene Ontology,GO)分析这一标准化的基因功能分类体系,从蛋白参与的生物过程(Biological Process,BP)、细胞组分(Cellcular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)三个方面描述生物体中基因和基因产物的属性。7利用KAAS(KEGG Automatic Annotation Server)将目标蛋白序列与KEGG GENES数据库中的人类蛋白序列进行比对,通过同源/相似蛋白的KO号注释到相关KEGG通路上。结果:1共纳入研究对象40例,其中HIV/AIDS湿热内蕴证患者24例,同地区健康人16例,两组在年龄、性别组成上无明显差异,两组在CD4、CD8、CD4/CD8水平上,p<0.05,均存在统计学差异。湿热内蕴证组的CD4及CD4/CD8水平明显低于健康对照组,湿热内蕴证组的CD8水平高于健康对照组。2去除高丰度蛋白后的血清蛋白样品丙稀铣胺凝胶电泳条带较去除前明显增多,高丰度蛋白的遮蔽作用明显降低,电泳条带较清晰。3实验共鉴定到的蛋白质组(Protein Group)为279个,其中各通道标记标签皆有定量信息的蛋白质有195个,共鉴定到唯一肽段2612个。4质谱结果中组间比值改变结合t-test分析计算出显著性指数(P value)进行差异表达蛋白筛选:以倍数改变≥1.2或<0.83,P<0.05为标准,共鉴定差异表达蛋白24个,其中12个表达上调,12个表达下调。5 ELISA验证结果和质谱结果蛋白上下调一致且具有统计学意义的共有血小板因子4、凝溶胶蛋白两个蛋白。6在功能注释(Annotation)过程中共48条蛋白序列被492条GO功能条目注释。差异表达蛋白细胞组分涉及细胞成分、膜成分、细胞外区域、膜内腔、大分子混合物、细胞外基质7个方面;分子功能涉及受体激活、催化活性、转运活化、结合、信号传导等6个方面;生物过程涉及生物调节、细胞生理过程、刺激反应、新陈代谢、多细胞生物过程等16个方面。7 KEGG通路注释共提取到与24个目标蛋白序列相关的7条KEGG信号/代谢通路:受体激活、细胞因子受体相互作用、血管平滑肌收缩、补体和凝血途径、Fc-γ-R介导的吞噬作用、金黄色酿脓葡萄球菌感染、系统性红斑狼疮。结论:1运用iTRAQ-MS技术筛选HIV/AIDS湿热内蕴证差异表达蛋白的研究方案是可行而有效的。2安捷伦多重亲和离心小柱Human-14的去除高丰度蛋白的效果显著,能减少高丰度蛋白对低丰度蛋白的遮蔽,有利于对差异蛋白的研究。3凝溶胶蛋白在中枢证神经系统损伤和艾滋病诱发肿瘤方面有较大的相关性。4MASP2参与的金黄色酿脓葡萄球菌感染通路,可能与艾滋病湿热内蕴证患者出现腹泻,便溏不爽症状相关联。5α-1抗胰蛋白酶缺乏可能是HIV感染的危险因素,同时也有望成为艾滋病湿热内蕴证潜在的蛋白质物质基础。