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细菌磁小体(BMPs)是趋磁细菌细胞内合成的磁性纳米颗粒,其组成为Fe<,3>O<,4>的晶体以脂膜包被。磁小体具有优良载体的性质,分别在固定化酶、吸附核酸用于基因枪弹、连接抗体进行免疫检测和载药后进行靶向治疗肿瘤等方面,具有广阔的应用前景。
本室的前期研究已经解决了趋磁螺菌(Magnetospirillum gryphiswaldense)的深层培养问题,细胞的培养水平高于目前报道的5倍以上。本论文对纯化磁小体的多种方法进行比较,证明了细胞压榨机对细胞的破碎效果优于超声波,一次(1000 psi)可破碎90%的细胞,而在后续的洗涤步骤中,只需采用超声波轻微击打,配合磁铁吸附回收,即可获得纯净的磁小体。纯化的磁小体分别经电镜、红外和能谱进行检测。电镜观察表明,纯化磁小体的晶型稳定,颗粒均匀,直径多在25~45nm,外膜完整;不同批次纯化的磁小体在PBS缓冲体系(pH 7.4)中的红外检测波峰分布一致,能谱检测结果显示纯化的磁小体含有C、O、Fe、P、N等元素,无其他杂质存在,配合生化方法检测,建立了纯净磁小体标准红外谱图,并建议将其作为批量生产的检测标准。
比较并摸索了多种磁小体的灭菌方法,实验结果证明,r-射线灭菌是一种简便有效的手段。经MTT实验证明,灭菌后的磁小体对小鼠纤维原细胞L-929无毒害,利用家兔法证明纯净磁小体不含内毒素,可以将磁小体作为载体应用到细胞和动物体内的实验中。
通过优化磁小体与乙肝表面抗原抗体的连接方法,使连接效率提高到527μg抗体/mg磁小体。选用辣根过氧化物酶系统结合化学发光,用双抗体夹心法检测乙肝表面抗原,检测限可达到0.1ng/ml,灵敏度比酶免方法提高了5倍。通过对临床109份血清样本的检测,结果与酶免的方法100%吻合,说明该方法可以应用到临床样本的检测中。
利用聚乙烯亚胺(PEI)将BMPs和DNA连接形成复合物,进行体外细胞转染及动物体内基因传递实验,结果证实BMPs-PEI体系不仅能有效地将DNA递送到细胞内和动物体内并正常表达,也可作为核酸疫苗的增强剂而极大地刺激体内的免疫反应。当PEI与DNA的N/P比为8时,BMPs-PEI能达到较佳的转染效果;当N/P为8时,BMPs与DNA的质量比在0.5:1时转染效率可以达到最高。当BMPs存在时,BMPs-PEUDNA复合物可以抵御DNase-I的“消化”作用。在磁场的作用下,BMP-PEI/DNA能加速到达细胞的表面促进质粒DNA进入细胞。BMPs-PEI之所以能起到提高转染效率的作用,可能的原因是该系统具备渗透溶酶体的能力,促使目的DNA顺利到达细胞核内。BMPs-PEI和BMPs-PEI/DNA复合物对细胞几乎没有毒性。这是因为BMPs的膜上本身带有负电荷,可以中和一部分PEI上的正电荷,从而减轻对细胞的伤害。在磁场的作用下BMPs-PEI系统能明显增强β-半乳糖苷酶在体内的表达水平。以口蹄疫病毒核酸疫苗为实验材料,检测了BMPs-PEI在体内引起细胞免疫和体液免疫的水平,在磁场的作用下,该系统能显著增强机体免疫应答水平。因此,BMPs-PEI可以作为一种新型的载体系统应用到基因传递中。