志贺毒素(Shiga toxin, Stx)是肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E. coli, EHEC)O157:H7及其他肠出血性大肠杆菌所产生的蛋白毒素中的一员,是产志贺毒素大肠杆菌(Shiga toxin producing E. coli, STEC)的主要毒力因子。Stx作为一种毒性极强的菌外毒素,小鼠LDso仅为1ng,其毒性分别是有机磷神经毒剂VX和沙林的7,000倍和45,000倍,因此成为潜在的生物恐怖病原,受到各国政府和科学家的重视。Stx家族包括Stx1和Stx2,其中Stx2被认为是感染性溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)的主要致病原,严重危害感染人群中的老人和儿童的生命安全。本论文针对毒性活性较强的Stx2作为研究对象,通过阐明Stx2在大鼠体内的代谢规律及组织分布特征,为进一步明确Stx2的致病机理提供了新的试验依据,同时为今后Stx2相关性疾病防治药物的筛选评价提供了相关技术和试验模型。一、Stx2的制备及纯化Stx2蛋白的制备和纯化是本研究的首先要解决的技术问题。已有多篇文献报道克隆表达志贺毒素亚单位,而全毒素克隆表达报道很少,因为难以得到纯度高、产量高、生物活性高的重组志贺毒素全毒素(rStx)。首先,Stx的两个亚单位需要分别表达,然后组装成AB5型结构；其次,当rStx表达后,需将其从众多杂蛋白中分离纯化出来,并且达到后期实验要求的高浓度及纯度。在前期工作中,课题组利用基因重组技术,采用一种简单的方法来构建重组质粒pET32a-stx2,通过自动诱导系统获得高产带有组氨酸标签的rStx2,然后,通过镍柱纯化带组氨酸标签的rStx2。SDS-PAGE分析纯化产物：Stx2A分子量约为32kDa, Stx2B分子量约为7.7kDa; Native-PAGE分析全毒素分子量约为70 kDa,与预期一致。经多次优化实验条件后,我们获得一批可应用于后期实验的rStx2,考马斯亮蓝法检测其蛋白浓度可达1.2mg/ml; Bandscan5.0软件分析蛋白纯度达96.6%；毒性活性实验结果表明：制备的rStx2具有HeLa细胞毒的CD50为0.5ng和小鼠LD50为2.3μg/kg,与天然志贺毒素的毒性活性相似。因此,本研究中的rStx可应用于体内外染毒模型的建立、药物的筛选与评价等。二、放射性125I标记Stx2的方法学建立与活性鉴定Stx2作为一种分子量为70kDa的大分子蛋白,它在体内的代谢及转化是十分复杂的,目前还没有具体的检测方法和评价标准,常参考蛋白类药物的实验方法及检测手段。放射性同位素作为示踪剂不仅灵敏度高,测量方法简便易行,还能准确地定量定位,符合所研究对象的生理条件。在Stx的体内外研究中,已有研究者们采用放射性125I标记毒素蛋白检测或跟踪其在动物体内的动态迁移。本研究中,我们使用半衰期为60天的放射性核素125I作为放射性示踪剂,对Stx2进行标记。经过125I标记纯化后所获得的125I_Stx2样品,经测定其标记率为31.8%,放化比活为9.6kbq/ml,浓度为0.6 mg/ml,生物活性与标记前没有明显改变,达到用于体内外试验对样品的要求。为后期研究Stx2在机体内的代谢及组织分布的工作建立一种可靠、灵敏的检测手段,奠定了坚实的实验基础。三、Stx2在动物体内的代谢及组织分布Stx2是一种致死性蛋白毒素,其相关性感染可引起系统性损伤,特别是出血性尿毒综合症(hemolytic uremic syndrome, HUS),对儿童的危害极大。目前,对于Stx2相关性感染尚无有效的治疗方案。因此,了解Stx2在机体内的代谢规律及组织分布特点有利于阐明Stx2尚不明确的致病机理,为治疗Stx2相关性感染提供相关的实验依据。在本论文中,我们采用经典的放射性碘追踪手段对Stx2在机体内的动态进行了详细的描述。尾静脉输注不同剂量(5.1-127.5μg/kg)的125I-Stx2于大鼠体内,通过γ-计数仪测定不同时间点血样中及各组织中的cpm值,根据所得的cpm值明确Stx2在大鼠体内的代谢动力学规律及组织分布特征。结果表明,Stx2在大鼠体内的代谢符合剂量依赖型-非线性代谢动力学规律(dose-dependent and nonlinear toxicokinetics course), Stx2的快分布半衰期(tl/2a)短暂,均小于6min,而消除半衰期相对较长。当Stx2的给予量为25.5μg/kg和127.5μg/kg时,其代谢动力学模型符合三室模型(three-compartment model),清除半衰期(t1/2 y)分别为27.8h和22h；当Stx2的给予量为5.1μg/kg时,其代谢动力学模型符合二室模型(two-compartment model),清除半衰期(t1/2β)为2.6h。Stx2在大鼠体内的组织分布主要集中在肺和肾脏,鼻甲骨中检测到大量的放射值(cpm),有时也会在眼组织中检测到高的cpm值,后者在目前的文献中尚未有报道。除此之外,我们还检测到Stx2造成大鼠肾脏和胸腺严重损伤,并观察到Stx2使大鼠的盲肠发生明显炎症,胃潴留等现象。总之,我们通过对Stx2在大鼠体内的研究,指出Stx2这种强毒性蛋白毒素在大鼠体内的代谢符合剂量依赖型-非线性代谢动力学规律,其快分布半衰期极短,少于6min,提示在抗Stx2相关行感染的治疗中应检测Stx2在血液中的水平,结合考虑Stx2在机体内的快速分布期,尽早给予抗Stx2的药物以阻断Stx2与机体内各靶组织的结合,减少Stx2对机体的伤害,为制定抗Stx2的有效治疗方案提供可靠的实验依据；此外,Stx2的组织分布及病理检测的结果指出Stx2在眼组织中有分布,对胸腺、盲肠和胃产生明显损伤,这些填补了Stx2尚未发现的组织分布和损伤,提示Stx2的相关性感染可能引起这些器官的损伤,应在防治Stx2相关性感染的过程中对这些组织器官进行检查并采取相应的预防措施,减少Stx2引起的系统性损伤。四、共聚焦显微镜(CLSM)及活体成像技术在Stx2体内外示踪检测中的初步应用随着科学技术的发展,生物领域中的检测方法不断更新,基于后期试验工作的需要,我们基于共聚焦显微镜(CLSM)及活体成像技术,建立针对毒素蛋白的细胞水平和机体系统水平的示踪检测方法。在本章研究中,我们使用共聚焦显微镜成功地描述了Stx2进入HeLa细胞的动态过程：将Stx2与HeLa细胞孵育,0时间点时,Stx2主要分布在HeLa细胞的表面即细胞膜上；30min时,Stx2部分分布在细胞膜上,部分进入细胞内,在细胞质及细胞核周围均有分布；60min时,Stx2主要分布在细胞核周围,荧光量明显减少。本结果客观地描述了Stx2通过与HeLa细胞膜的结合进入细胞内部,到达细胞核的过程。发现Stx2与HeLa细胞孵育60min时,被细胞大量降解,表明HeLa细胞具有对Stx2降解的功能,且降解时间段主要在Stx2与HeLa细胞结合后的60min左右,同时这也可能是Stx2的A亚单位执行其细胞毒性的时间段。此外,我们利用活体成像技术观察Stx2在小鼠体内的动态迁移,发现在小鼠肝部位的荧光随着时间的延长而增强,i.v.后30min时荧光最强,随后荧光减弱,推测Stx2于i.v.后的前30min内主要流向肝脏；而在小鼠膀胱中的荧光于i.v.后30min逐渐增强,50min时最强,推测Stx2于i.v.后30min开始排泄。本部分研究,我们尝试通过共聚焦显微镜和活体成像这两种在国际上较为前沿的技术,建立对Stx2体内外的检测方法,为后期的抗Stx药物发展提供新的检测分析手段。