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Tim-1是哮喘和过敏症的易感基因,优先在Th2细胞表达,是T细胞活化的共刺激分子。近年来发现Tim-1异常表达与多种癌症有关,如在非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)中Tim-1表达异常,在NSCLC细胞系中敲低Tim-1后能通过下调PTEN/AKT通路抑制细胞活力、细胞迁移和侵袭能力。目前,Tim-1在淋巴细胞中被认为能够促进IL-10、TGF-β等细胞因子的分泌,在调节免疫细胞活性中发挥着重要作用。而其中TGF-β与胶质瘤的恶性程度密切相关,且与胶质瘤患者的预后有关。已有研究发现Tim-1在中枢神经系统中存在表达,如少突胶质细胞。并且Tim-1在原发性中枢神经系统淋巴瘤中也存在异常表达现象,与细胞因子IL-10的表达呈正相关。结合脑胶质瘤的肿瘤微环境机制,这些研究预示着Tim-1可能对脑胶质瘤微环境中细胞因子的分泌中起重要作用,从而参与胶质瘤的发生和发展过程。在这里我们研究了Tim-1在人脑胶质瘤中的表达情况及其意义。利用分子生物学方法分析研究了Tim-1对胶质瘤细胞生物学功能的影响,并深入分析了相关机制,为以Tim-1为靶点的脑胶质瘤的免疫治疗提供理论基础。本课题将从以下三个部分进行研究:第一章 Tim-1在胶质瘤临床标本和细胞系中的表达研究目的:研究Tim-1在胶质瘤临床组织和细胞系中的表达情况,构建敲低Tim-1表达的胶质母细胞瘤细胞系。方法:通过微阵列分析发现正常脑组织和脑胶质瘤组织差异表达的基因。通过免疫组化、蛋白免疫印记(Western Blot)、免疫荧光染色、实时定量聚合酶链式反应(q RT-PCR)方法比较:1)胶质瘤临床标本和正常脑组织标本中Tim-1表达差异;2)胶质母细胞瘤细胞系(U87和U251)和正常脑胶质细胞系(HEB)中Tim-1表达情况。采用Tim-1 sh RNA慢病毒转染U87及U251细胞,构建Tim-1敲低后的稳转细胞系,并应用Western Blot和q RT-PCR验证病毒转染效率。结果:1)同正常脑组织相比,Tim-1在高级别胶质瘤中表达明显升高,且Tim-1表达水平和胶质瘤恶性程度成正相关。2)在U87和U251细胞中Tim-1表达水平较HEB细胞显著升高。3)Tim-1敲减慢病毒转染的效率明显,成功构建Tim-1低表达的U87和U251细胞系。结论:同正常脑组织及HEB细胞系相比,Tim-1在高级别胶质瘤和胶质母细胞瘤细胞系U87和U251中的表达均明显升高。第二章 Tim-1在胶质母细胞瘤增殖和侵袭中的作用研究目的:探究Tim-1敲低对胶质母细胞瘤细胞增殖、侵袭及凋亡作用的影响。方法:CCK-8增殖实验检测敲低Tim-1对胶质瘤细胞增殖的影响,通过划痕实验和Transwell实验检测Tim-1敲低对胶质瘤细胞迁移及侵袭能力的影响。通过流式细胞技术检测Tim-1敲低后细胞的凋亡情况。利用Western Blot验证细胞凋亡指标cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2以及细胞侵袭相关蛋白MMP-2和MMP-9的表达水平变化。构建裸鼠皮下成瘤实验验证Tim-1敲低胶质瘤细胞系在体内环境下对肿瘤发展的影响。结果:1)敲低Tim-1可以显著抑制U87和U251细胞的增殖、迁移和侵袭能力。2)Tim-1敲低后U87和U251细胞的凋亡无明显改变。3)在敲低Tim-1的U87和U251细胞中MMP-2和MMP-9蛋白水平显著降低,凋亡相关指标cleaved-caspase3、Bax、Bcl-2蛋白水平在Tim-1敲低后则无显著性变化。4)敲低Tim-1后的U87细胞构建的皮下肿瘤模型显著抑制了成瘤模型中肿瘤的生长及进展。结论:在胶质瘤母细胞瘤细胞系U87和U251中,敲低Tim-1可以显著抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,但是并不影响肿瘤细胞的凋亡。第三章 Tim-1介导TGF-β-microRNA-133a-TGFBR1信号轴对胶质母细胞瘤增殖和侵袭的调控作用研究目的:探究Tim-1敲低对胶质母细胞瘤细胞自分泌细胞因子TGF-β表达的影响及其引起的信号转导机制对胶质母细胞瘤细胞增殖和侵袭的调控作用。方法:通过酶联免疫吸附实验(ELISA)测定Tim-1敲低后的U87和U251细胞中细胞因子IL-4和TGF-β1的表达水平。通过RNA-seq技术分析Tim-1敲低后的U87和U251细胞中显著差异表达的基因及生物信息学分析差异通路。通过Western Blot实验确定Tim-1敲低后的U87和U251细胞中Stat3和TGFBR1的蛋白表达变化。通过q RT-PCR确定Tim-1敲低后的U87和U251细胞中micro RNA-133a的表达变化。通过RNA免疫共沉淀(RNA-IP)实验分析micro RNA-133a对TGFBR1 3’UTR区的结合情况及其对TGFBR1蛋白表达的影响。干预Tim-1敲低后的U87和U251细胞中micro RNA-133a和TGFBR1的表达水平,通过CCK-8增殖实验、Transwell实验、划痕实验检测micro RNA-133a和TGFBR1对Tim-1敲低引起的胶质瘤细胞增殖、迁移及侵袭能力的逆转作用,确定Tim-1对TGF-β-micro RNA-133a-TGFBR1信号轴的影响;利用Western Blot实验验证Tim-1敲低后对MEF2C蛋白表达的影响,确定Tim-1敲低是否可以通过上调MEF2C活性增加micro RNA-133a的表达。结果:1)Tim-1敲低后显著抑制胶质瘤细胞中TGF-β1的表达。2)Tim-1敲低后显著降低了Stat3活化,并引起Stat3和TGFBR1蛋白表达下调。3)Tim-1敲低可以显著增加micro RNA-133a的表达。4)micro RNA-133a能靶向结合TGFBR1 3’UTR区,破坏TGFBR1 m RNA稳定性并抑制TGFBR1蛋白表达。5)抑制micro RNA-133a能逆转Tim-1敲低后引起的胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。6)过表达TGFBR1能逆转Tim-1敲低后引起的胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的降低。7)Tim-1敲低后能通过上调MEF2C磷酸化修饰水平增加MEF2C活化,从而增加micro RNA-133a的表达。结论:Tim-1敲低后能抑制胶质母细胞瘤细胞中TGF-β1的表达,并通过上调micro RNA-133a的表达抑制了TGFBR1的表达,并进一步通过TGF-β-MEF2Cmicro RNA-133a-Stat3/TGFBR1信号轴参与了对胶质母细胞瘤的增殖、迁移和侵袭过程的影响。