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研究背景和目的
缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点，已经成为中国成人致残和致死的首要原因。早期危险因素的识别和控制对预防缺血性脑卒中的发生具有重要意义。甘油三酯(triglyceride，TG)水平升高是缺血性脑卒中的重要危险因素。然而，关于TG导致缺血性脑卒中风险升高的机制以及TG水平升高的遗传易感性尚不清楚。2015年11月NatureGenetics杂志报道了由本课题组参与的国际合作的56所大学或科研机构完成的一项大型GWAS研究的结果。该研究确定了12个新SNPs及基因组区域与血压表型存在显著关联，并经进一步研究发现3个基因AMH、DOT1L和PLEKHJ1的DNA甲基化对血压的调控具有重要作用。该项结果为动脉粥样硬化性疾病的病因机制的研究奠定了重要基础。因此，本研究利用病例对照研究方法探讨AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化与缺血性脑卒中的关系以及这3个基因DNA甲基化在高TG水平与缺血性脑卒中关联中的中介效应。
材料和方法
选取经核磁或CT确诊的缺血性脑卒中病例354例和性别、年龄相匹配的健康对照342例作为本研究的对照。收集病例和对照的人口统计学特征、生活方式危险因素、心血管病家族史和个人疾病史等资料。采集血标本分离血清及提取DNA，用商品化的标准试剂盒检测TG等血脂指标，采用亚硫酸氢盐测序方法检测AMH、DOT1L和PLEKHJ1基因DNA甲基化。采用多元Logistic回归模型和多元线性模型，分析AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化与缺血性脑卒中危险的关联;分析TG与AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化的关联。采用中介效应模型分析AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化在TG与缺血性脑卒中风险之间的中介效应。
结果
1、AMH基因的23个CpG甲基化位点、DOTIL基因的8个CpG甲基化位点和PLEKHJ1基因的2个CpG甲基化位点的DNA甲基化水平，在缺血性脑卒中病例组和对照组之间存在显著差异(均P＜0.05)。除DOTIL基因的1个位点(Chr19:2164132)的DNA甲基化水平为对照组低于病例组外，其他所有CpG位点的DNA甲基化水平均为对照组高于病例组。
调整性别、年龄、BMI、WC、收缩压、舒张压、吸烟、饮酒等混杂因素后，AMH基因的23个甲基化位点中，有19个位点的DNA甲基化与缺血性脑卒中显著关联(均p值＜0.05);DOTIL基因的8个CpG甲基化位点中有2个位点(Chr19:2164123;Chr19:2165251)的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联(均p值＜0.05);PLEKHJ1基因的2个CpG甲基化位点中有1个位点(Chr19:2236887)的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联(均p值＜0.05);这些CpG位点DNA甲基化水平升高可降低缺血性脑卒中的危险性。调整性别、年龄、BMI、WC、收缩压、舒张压、吸烟和饮酒等混杂因素，AMH、DOT1L和PLEKHJ1等3个基因的集合(基因集)CpG位点的平均DNA甲基化水平与缺血性脑卒中存在显著的关联关系[OR=0.85(0.77-0.96),P=0.006]。
2、调整性别、年龄、吸烟、饮酒、BMI、WC和是否患脑卒中等混杂因素后，TG水平与AMH基因的chr19:2252448、chr19:2252386和chr19:2252376CpG位点的甲基化水平呈现负向关联关系，即随着TG水平的升高，AMH基因的DNA甲基化水平下降，Beta分别为-0.15(P=0.049)、-0.09(P=0.023)和-0.03(P=0.038)。TG水平与AMH基因的相关CpG位点的平均甲基化水平以及3个基因(基因集)的所有相关CpG位点的甲基化水平存在显著的负相关关系，Beta分别为-0.08(P=0.043)和-0.04(P=0.048)。
3、中介分析结果显示，AMH基因CpG位点chr19:2252456、chr19:2252431、chr19:2252394、chr19:2252389、chr19:2252364、chr19:2252518、chr19:2252505和chr19:2252473在TG与缺血性脑卒中的关联中的效应分别为3.83％(1.29％～13.26％)、4.33％(0.38％～15.16％)、2.02％(0.12％～10.34％)、3.04％(0.18％～13.20％)、5.65％(1.81％～15.32％)、7.03％(2.66％～14.86％)、3.81％(0.47％～9.58％)和5.65％(0.21％～12.70％)，均P＜0.05。AMH基因相关CpG位点的甲基化在TG与缺血性脑卒中关联关系中的平均效应为5.83％(2.12％-15.14％);AMH、DOT1L和PLEKHJ基因的所有相关CpG位点的甲基化在TG与缺血性脑卒中关联关系中的平均效应为7.16％(1.80％～16.90％)。
结论
1、AMH基因的23个CpG甲基化位点、DOTIL基因的8个CpG甲基化位点和PLEKHJ1基因的2个CpG甲基化位点的DNA甲基化水平，在缺血性脑卒中病例组和对照组之间存在显著差异。
2、AMH基因有19个CpG位点的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联，DOTIL基因有2个CpG位点的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联，PLEKHJ1基因有1个CpG位点的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联;这些CpG位点的DNA甲基化水平升高可降低缺血性脑卒中的危险性。
3、TG水平与AMH基因的chr19:2252448、chr19:2252386和chr19:2252376CpG位点的甲基化水平呈现负向关联关系，即随着TG水平的升高，AMH基因的DNA甲基化水平下降。
4、AMH基因的8个CpG位点的DNA甲基化在TG与缺血性脑卒中关联关系中的具有中介效应。本研究结果为TG与缺血性脑卒中的危险性的关联提供了表观遗传学证据。
缺血性脑卒中具有高发病率、高致残率和高死亡率等特点，已经成为中国成人致残和致死的首要原因。早期危险因素的识别和控制对预防缺血性脑卒中的发生具有重要意义。甘油三酯(triglyceride，TG)水平升高是缺血性脑卒中的重要危险因素。然而，关于TG导致缺血性脑卒中风险升高的机制以及TG水平升高的遗传易感性尚不清楚。2015年11月NatureGenetics杂志报道了由本课题组参与的国际合作的56所大学或科研机构完成的一项大型GWAS研究的结果。该研究确定了12个新SNPs及基因组区域与血压表型存在显著关联，并经进一步研究发现3个基因AMH、DOT1L和PLEKHJ1的DNA甲基化对血压的调控具有重要作用。该项结果为动脉粥样硬化性疾病的病因机制的研究奠定了重要基础。因此，本研究利用病例对照研究方法探讨AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化与缺血性脑卒中的关系以及这3个基因DNA甲基化在高TG水平与缺血性脑卒中关联中的中介效应。
材料和方法
选取经核磁或CT确诊的缺血性脑卒中病例354例和性别、年龄相匹配的健康对照342例作为本研究的对照。收集病例和对照的人口统计学特征、生活方式危险因素、心血管病家族史和个人疾病史等资料。采集血标本分离血清及提取DNA，用商品化的标准试剂盒检测TG等血脂指标，采用亚硫酸氢盐测序方法检测AMH、DOT1L和PLEKHJ1基因DNA甲基化。采用多元Logistic回归模型和多元线性模型，分析AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化与缺血性脑卒中危险的关联;分析TG与AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化的关联。采用中介效应模型分析AMH/DOT1L/PLEKHJ1基因DNA甲基化在TG与缺血性脑卒中风险之间的中介效应。
结果
1、AMH基因的23个CpG甲基化位点、DOTIL基因的8个CpG甲基化位点和PLEKHJ1基因的2个CpG甲基化位点的DNA甲基化水平，在缺血性脑卒中病例组和对照组之间存在显著差异(均P＜0.05)。除DOTIL基因的1个位点(Chr19:2164132)的DNA甲基化水平为对照组低于病例组外，其他所有CpG位点的DNA甲基化水平均为对照组高于病例组。
调整性别、年龄、BMI、WC、收缩压、舒张压、吸烟、饮酒等混杂因素后，AMH基因的23个甲基化位点中，有19个位点的DNA甲基化与缺血性脑卒中显著关联(均p值＜0.05);DOTIL基因的8个CpG甲基化位点中有2个位点(Chr19:2164123;Chr19:2165251)的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联(均p值＜0.05);PLEKHJ1基因的2个CpG甲基化位点中有1个位点(Chr19:2236887)的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联(均p值＜0.05);这些CpG位点DNA甲基化水平升高可降低缺血性脑卒中的危险性。调整性别、年龄、BMI、WC、收缩压、舒张压、吸烟和饮酒等混杂因素，AMH、DOT1L和PLEKHJ1等3个基因的集合(基因集)CpG位点的平均DNA甲基化水平与缺血性脑卒中存在显著的关联关系[OR=0.85(0.77-0.96),P=0.006]。
2、调整性别、年龄、吸烟、饮酒、BMI、WC和是否患脑卒中等混杂因素后，TG水平与AMH基因的chr19:2252448、chr19:2252386和chr19:2252376CpG位点的甲基化水平呈现负向关联关系，即随着TG水平的升高，AMH基因的DNA甲基化水平下降，Beta分别为-0.15(P=0.049)、-0.09(P=0.023)和-0.03(P=0.038)。TG水平与AMH基因的相关CpG位点的平均甲基化水平以及3个基因(基因集)的所有相关CpG位点的甲基化水平存在显著的负相关关系，Beta分别为-0.08(P=0.043)和-0.04(P=0.048)。
3、中介分析结果显示，AMH基因CpG位点chr19:2252456、chr19:2252431、chr19:2252394、chr19:2252389、chr19:2252364、chr19:2252518、chr19:2252505和chr19:2252473在TG与缺血性脑卒中的关联中的效应分别为3.83％(1.29％～13.26％)、4.33％(0.38％～15.16％)、2.02％(0.12％～10.34％)、3.04％(0.18％～13.20％)、5.65％(1.81％～15.32％)、7.03％(2.66％～14.86％)、3.81％(0.47％～9.58％)和5.65％(0.21％～12.70％)，均P＜0.05。AMH基因相关CpG位点的甲基化在TG与缺血性脑卒中关联关系中的平均效应为5.83％(2.12％-15.14％);AMH、DOT1L和PLEKHJ基因的所有相关CpG位点的甲基化在TG与缺血性脑卒中关联关系中的平均效应为7.16％(1.80％～16.90％)。
结论
1、AMH基因的23个CpG甲基化位点、DOTIL基因的8个CpG甲基化位点和PLEKHJ1基因的2个CpG甲基化位点的DNA甲基化水平，在缺血性脑卒中病例组和对照组之间存在显著差异。
2、AMH基因有19个CpG位点的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联，DOTIL基因有2个CpG位点的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联，PLEKHJ1基因有1个CpG位点的DNA甲基化水平与缺血性脑卒中显著关联;这些CpG位点的DNA甲基化水平升高可降低缺血性脑卒中的危险性。
3、TG水平与AMH基因的chr19:2252448、chr19:2252386和chr19:2252376CpG位点的甲基化水平呈现负向关联关系，即随着TG水平的升高，AMH基因的DNA甲基化水平下降。
4、AMH基因的8个CpG位点的DNA甲基化在TG与缺血性脑卒中关联关系中的具有中介效应。本研究结果为TG与缺血性脑卒中的危险性的关联提供了表观遗传学证据。