研究背景及目的男性不育的诊断与治疗是男科学领域的一个难题,目前,男性不育的诊疗水平远远不能满足广大不育患者的要求,且不育症的发病率呈现升高的趋势。近年来,随着精原干细胞移植技术的发展,将为这一难题探索出一种新的治疗方法。精原干细胞（SSCs）是哺乳动物成体睾丸生精上皮内唯一可复制的多潜能二倍体细胞,它能在体外分离、纯化、培养、冻存及同体或异体移植。1994年,Brinster实验室首次报道了SSCs移植,并证明它在运用于干细胞以及支持细胞、生殖细胞相互关系的研究中是一项技术性的突破。运用该技术不仅能将SSCs从一个动物成功移植到另一个同种属动物体内（同种基因移植）,而且也能移植到不同种属动物体内（异种基因移植）。伴随精原干细胞群的分离培养、富集和冻存的发展及转基因技术的运用,SSCs移植将为治疗雄性不育、生产转基因动物及为不育患者选择基因治疗提供一条新的途径。这项技术将应用于基础科学、人文医学和家畜及野生动物繁殖。精原干细胞具有永生化和多能化潜能,是精子形成的前体细胞,在睾丸微环境中具有增殖和分化的能力。精原干细胞移植为男性不育症的治疗开启了一扇新的大门。本实验中,我们通过比较不同的受体动物处理方法,探索用于精原干细胞移植的受体动物的合适的造模方法,另外探索精原干细胞分离纯化的方法和同种异体精原干细胞的移植方法,并对移植效果做出评价,通过动物实验为将来的临床应用提供理论和技术支持。方法一探讨合适的造模方法将S-D大鼠随机分为7组,每组10只,分别采用钴⁶⁰9Gy、8Gy、7Gy、6Gy、6Gy剂量间隔一周照射两次、白消安40mg/kg单次腹腔注射组,另外一组为正常对照组。观察干预后三个月的死亡率,分别于干预后一月、三月取大鼠的睾丸做病理。通过死亡率和睾丸病理情况判断不同剂量钴⁶⁰照射以及白消安腹腔注射的造模效果,为后续的精原干细胞移植提供合适的受体动物模型。二建立用于移植的不育动物模型取8周龄的S-D大鼠15只,体重200±20g,以钴⁶⁰6 Gy剂量做全身照射,一周后相同剂量再次全身照射,四周后予以移植。三分离培养精原干细胞取9-10日龄的S-D大鼠的睾丸,采用机械法+两步酶消化法+差速贴壁法提取精原干细胞。断颈法处死大鼠,无菌收集双侧睾丸,置于盛有HBSS的圆盘中,仔细剥除脂肪垫、附睾、睾丸被膜,并以HBSS反复轻缓吹打。将睾丸组织转移至特制小器皿中,皿内盛少量HBSS,用眼科剪将组织剪至粉末状,将粉末状组织转移至已放置搅拌器的青霉素瓶中。加入相当于组织10倍体积的1mg/mlⅣ型胶原酶溶液,在37℃消化15min,并在磁力搅拌器上轻缓搅拌。静置10min,吸出上清并弃之,向青霉素瓶内加入含0.5mg/mlDNasel+0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA的复合酶溶液,在37℃消化10min,并在磁力搅拌器上轻缓搅拌。加入FBS终止胰蛋白酶消化,加入HBSS稀释并轻缓吹打。将消化后的细胞悬液分别经200目、400目的筛网过滤后,将细胞悬液收集在离心管内,以1000r/min离心3min。弃上清,加入新鲜配制的完全培养液,调整细胞密度为3×10⁶个/ml。将细胞接种至用光学透明纯聚苯乙烯制造的25cm²细胞培养瓶,在37℃、5%CO₂培养箱中孵育4h,收集尚未贴壁的悬浮细胞,以1000r/min离心3min,加入培养液,重新调整细胞密度为3×10⁶个/ml。四精原干细胞移植到受体动物受体动物选择约8周龄,体重200g左右的S-D大鼠,采用钴⁶⁰6 Cy剂量间隔一周照射两次,照射一个月后行精原干细胞移植。（1）大鼠称重后,以10%水合氯醛按照300mg/kg（0.3ml/100g）体重进行腹腔注射麻醉。（2）大鼠取仰卧位,消毒下腹会阴区,取阴囊正中切口长约2cm,切开阴囊各层,将两侧睾丸拉出阴囊置于纱布上。（3）参照文献方法,用1ml注射器穿刺一侧睾丸网,注入精原干细胞悬液,另一侧睾丸作自身对照。移植后清洁开放环境中饲养。五移植效果的评价于移植后2个月,切取睾丸,用Bouin’s液（饱和苦味酸水溶液75ml、福尔马林25ml、冰醋酸5ml）固定24h。行苏木精伊红染色,光镜下观察移植组睾丸和对照组睾丸的病理学表现,免疫组化SABC法检测c-kit的表达。结果一9Gy组于放射后15天内全部死亡,死亡率为100%;8Gy组三个月内死亡4只,死亡率为40%,睾丸大小与对照组相比明显减小,睾丸各级生精细胞明显减少;7Gy、6Gy组三个月内各死亡两只,死亡率20%,两组睾丸大小与对照组相比无明显差异,仅见部分生精细胞层次减少,部分细胞排列紊乱:6Gy间隔一周照射两次组分别于照射后5天15天各死亡一只,死亡率20%,睾丸大小与对照组相比缩小明显,睾丸各级生精细胞明显减少,生精小管多数呈“空泡化”;白消安腹腔注射组生精细胞层次紊乱减少,但是仍可见数层生精细胞。选择钴⁶⁰6Gy间隔一周照射两次为受体动物造模方法。二以6Gy剂量间隔一周照射两次作为造模方法,第二次照射后一月开始移植,移植前共死亡大鼠两只,移植前随机抽取两只大鼠做睾丸病理切片,可见各级生精细胞缺如,仅于曲细精管周见少量精原细胞。三干细胞分离后光镜下观察可见细胞大小不等,悬浮于培养液中,培养四个小时后,由于贴壁速度的不同,支持细胞、间质细胞先贴壁,而精原干细胞后贴壁,换液后可见细胞大小差异不明显,圆形,培养48小时后精原干细胞贴壁生长,免疫组化染色可见细胞膜和核周胞质c-kit和α₆-integrin呈阳性表达,证明为精原干细胞。四共移植10只S-D大鼠,每个睾丸注入细胞悬液或者相同剂量的移植介质0.2±0.05ml,移植后青霉素40万单位/只。天肌肉注射,持续三天,以预防切口感染,移植后第一天死亡1只,第10天死亡两只,以后无死亡。五移植后2月,大体观移植组睾丸与对照组2睾丸大小近似,大于对照组1。对照组1睾丸可见极少部分曲细精管恢复生精,大多数曲细精管管腔呈空泡样。移植组睾丸光镜下可见大部分曲细精管管腔存在各级生精细胞,仍可见部分未能恢复生精的曲细精管,c-kit的表达阳性程度强于对照组1,移植组曲细精管生精上皮的恢复明显优于对照组1。结论1钴⁶⁰6Gy间隔一周照射两次处理受体动物可为精原干细胞移植提供合适的动物模型。2精原干细胞细胞膜和细胞质有c-kit、α₆-integrin的阳性表达,c-kit和α₆-integrin可作为精原干细胞增殖与分化阶段的表面标志,用于精原干细胞的鉴定。3精原干细胞可以经睾丸网进行移植。移植后能在受体中增殖,并能分化形成成熟的精子。精原干细胞移植为转基因动物的繁育,治疗男性不育开辟了新的天地。