一株苯胺黑药降解菌的降解酶及降解机理的研究

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二苯胺基二硫代磷酸((C6H5NH)2PSSH,俗称苯胺黑药)是一种良好的有色金属硫化矿捕收剂,具有选择性好、捕收力强的特点,它对细粒方铅矿的捕收作用比甲酚黑药和乙黄药更为有效,被大量运用于铅锌硫化矿铜硫矿石的浮选。但其不易分解,残留时间长,是铅锌硫化矿铜废水中的一种主要污染物。本文以实验室筛选出的苯胺黑药降解菌AFF0039为研究对象,通过确定AFF0039产苯胺黑药降解酶的主要存在部位、诱导特性、降解酶的温度、pH反应特性及其温度、pH稳定性等考察了AFF0039产苯胺黑药降解酶的特性;并利用四因素五水平正交实验从培养温度,培养液的pH,培养的时间及添加的无机营养物质四个方面优化了AFF0039最佳生长条件,降解苯胺黑药的最优条件和最佳产酶条件。最后利用UV、GC/MS、 HPLC、IC结合分光光度法分析苯胺黑药及其中间产物,从而确定AFF0039降解苯胺黑药的机理和路径。主要得到以下结论:(1)AFF00039产生的苯胺黑药降解酶为诱导酶,大部分分布于细胞内,胞内提取液酶活达到20.24ug·(h·mL)-1,少部分在细胞外,细胞外提取液的酶活为6.01ug·(h·mL)-1,周质提取液基本不表现酶活。提取的苯胺黑药降解酶的最适反应温度为35℃~40℃。最适反应pH4.3~7.0。苯胺黑药降解酶在温度低于40℃的条件下保存3小时,其相对酶活能够保持在65%以上,保存温度为45℃时,相对酶活只有34.7%。苯胺黑药降解酶在pH为4.3~7.0,温度4℃保存3小时,稳定性较好,相对酶活达到了85%以上。pH越高,降解酶越不稳定。(2)通过正交实验,AFF0039接种于以苯胺黑药为单一碳源的培养液中,苯胺黑药最高去除率可达到98%以上,蛋白质产生量最大可达到102.93ug/mL以上,苯胺黑药降解酶活最大值达到48.22ug·(h·mL)-1.实验表明,培养的温度、pH和培养时间对苯胺黑药去除率,蛋白质产生情况及酶活的影响较大。AFF0039降解苯胺黑药的最佳培养温度是35℃~40℃,最佳培养pH为5~7。AFF0039菌株的产酶的最佳温度为35℃-40℃,最佳培养pH为6,产酶最大量的时间为12h~18h。外加氮源和磷源对苯胺黑药去除率、蛋白质产生情况及酶活的影响不大。(3)300mg/L苯胺黑药溶液中接种入AFF0039菌株24小时后,91.35%苯胺黑药被降解,而COD的去除率只有67.29%,磷酸根浓度由未接种时的31.4mg/L上升到了94.4mg/L。通过HPLC、IC、GC/MS及紫外可见光度法分析,苯胺黑药溶于水中即发生少量水解,生成生成磷酸根、苯胺、硫化氢。大部分的苯胺被AFF0039降解生成了邻苯二酚,其很快又被邻苯二酚2,3双加氧酶通过间位代谢降解生成2-羟基己二烯半醛酸,最终进入三羧酸循环被完全降解。小部分苯胺生成了不能被AFF0039降解的有机物、苯酚、苯醌、3-丁烯酰胺和2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚),这是COD偏高的原因。从GC/MS锋面积及HPLC中未知产物的保留时间(6.153±0.05min)判断2,2’-亚甲基双-(4-甲基-6-叔丁基苯酚)是HPLC检测中6.153±0.05min所对应的物质,也是残留量最多的有机污染物。同时AFF0039菌株在降解苯胺黑药的过程中,促进了磷酸根的生成,但AFF0039生长只需利用少量的无机磷营养物质,所以培养液的磷酸根浓度慢慢增加。
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