前言 胰腺移植特别是胰肾联合移植(SPK)是治疗糖尿病肾病终末期病人的最好办法。但移植后移植胰腺血栓形成成为导致移植胰腺丢失的主要原因之一。缺血引起再灌注早期血小板与血管内皮和细胞外基质的粘附和血小板活化。其中分布在内皮细胞中的维贝尔-帕拉得小体(Weibel-Palade body,WP)所含有的vWF(vonWillebrand factor,vWF)是内皮细胞活化的主要效应因子之一。本实验主要观察大鼠胰腺缺血再灌注后血清中vWF以及胰腺组织中vWF的表达，并根据vWF合成及分泌机制，引入细胞内钙离子螯合剂(BAPTA-AM)；阐释vWF与胰腺缺血再灌注后胰腺损伤和血栓形成的关系。 材料和方法 实验动物为雄性Wistar大鼠。建立大鼠胰腺缺血再灌注模型：腹正中切口，钳夹脾动脉以造成胰体尾部缺血，松开动脉夹进行再灌注。血样采集：于大鼠门静脉抽取血液检测vWF和淀粉酶。胰腺采集：将胰腺置于5％PBS甲醛中保存至检测。主要试剂包括vWF羊抗人抗血清(一抗)、二抗及免疫组化试剂盒(购自邦定生物技术有限公司)和细胞内钙离子螯合剂BAPTA-AM(购自上海康成生物工程有限公司)。 方法1．vWF测定包括 (1)免疫浊度法：用紫外分光光度计测量血中vWF。 (2)免疫组化：阴性对照采用PBS代替一抗。免疫组化切片用显微图像分析仪进一步分析。 2．改良苏氏法测定血淀粉酶。 3．统计学分析：数据用X土S表示，正态检测后用t检验和方差分析处理数据，方差不齐的数据进行数据转换，如仍不齐，则用非参数方法分析。P＜o．05认为有统计学意义。 结 果 假手术组 VWF总的平均值为：门4．49。6．87）％；缺血组中30为0s0和 120分钟组均较假手术组间明显升高（P＜0．05人缺血 90分钟后有所下降，缺血 60＼120分钟两组比假手术组和缺血30分钟组明显升高（P＜0．05厂同时又明显低于gO分钟组（P＜0．05八处理组中随时间的增加，血清中VWF值逐渐升高，90分钟和 6 ／J’时组 VWF值明显高于 30分钟和 60分钟组0＜0．05）和低于 12 ／J’时和 24 ／J’时组（P＜0．05）；24 ／J’时组的 VWF值明显高于其他各组u＜0．05人非处理组的变化趋势与处理组相似。横向比较，处理组30分钟、60分钟、90分钟为 小时、12 ／J’时和24 ／J’时各组的VW明显低于非处理组30分钟为0分钟s0分钟在 ／J’时＊ 2 ／J’时和 24 ／J’时各组的 VW（P＜0．05）。 再灌注60分钟时的淀粉酶明显高于对照组和再灌注30分钟组评＜O．05h再灌注go分钟在小时上2小时和24小时组间的淀粉酶明显高于再灌注3o分钟、闹分钟组和对照组u＜o．05人BAPI’A－AM组比生理盐水组的淀粉酶略有降低，但没有统计学差异（P＞0．05）。 病理组织学检查H．E染色，单纯缺血组中没有血栓，而在再灌注组中发现有血小板血栓形成，血管内白细胞向管壁靠近，而且再灌注组中出现血管周围炎性细胞浸润。免疫组化染色结果在正常大鼠胰腺中，可见内皮细胞仍完整的血管，白细胞位于轴流即血管中心，无VWF阳性染色；再灌注后，血管内皮呈棕黄色深染，说 ·2·明VWF阳性表达；应用BAgrA－AM后，血管内皮VWF染色减少，但仍可见血小板VW阳性染色。显微图像分析结果再灌注组＊J 组）较缺血组p－5组）和对照组一组）明显升高，而应用BA地一AM的再灌注组“人 组）明显低于生理盐水再灌注组（12一17 组）。 讨 论 缺血再灌注使胰腺的血管内皮在一开始就暴露在相当高的切变力之下，而与血小板表面的 GP－IX和 GP 11b／Illa结合中起主要作用的高分子量yWF正需要这一条件。本实验再灌注组中，随着时间的增加，血清中VWF值逐渐升高，90分钟和6 ／J’时组yWF值明显高于 30分钟和 60分钟组k＜0．05）和低于 12 ／J’时和 24 ／J’时组一＜0．05h 24 ／J’时组的 VWF值明显高于其他各组（P＜0．05人 同时，在高切变力的情况下，高分子量 VWF能与血小板紧密结合，促进其附壁。缺血再灌注中高切变的出现是暂时的，在再灌注后 60分钟时则降到正常的 50％以下。在这种情况下，帖壁滚动的白细胞增加了，同时滚动速度下降，这使白细胞更易于与在高切变下已经活化并附壁的血小板以及活化后的内皮细胞相互作用，通过P一选择素（P－s。，lectin）与P一选择素糖蛋白配体（P一 selectin gycoProtein ligand一l，PSGL一）的结合来促进白细胞的附壁和外渗。本实验的病理检查可见到再灌注组血管内白细胞向管壁靠近，而且出现血管周围炎性细胞浸润。低切变还可以促使血小板的运动速度下降并在VWF的作用下相互粘结，纤维蛋白原在低切变的条件下的促凝作用得到增强，它的存在使血小板的粘附和聚集更加容易，这时血栓形成已经不可逆了。本研究中，单纯缺血组中没有血栓，而在再灌注组中发现有血小板血栓形成。因为炎性细胞和介质以及血小板的参与，使得内皮细胞进一