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脂肪酶是一类能催化长链甘油三酯水解的水解酶,脂肪酶广泛应用于医疗和制药工业、食品工业、精细化学合成以及环境治理等领域。脂肪酶催化手性有机化合物合成,以及发生酯化、酸解、醇解等反应,是当今酶工程领域的研究热点。本实验室从国家海洋环境监测中心获得25株菌株,这些菌株来源于中国第四次北极科学考察的采集样品。论文研究的目的是筛选产低温脂肪酶的嗜冷细菌,分析表征嗜冷细菌脂肪酶的结构和酶学性质,便于脂肪酶的进一步开发利用。论文研究,采用维多利亚蓝和溴甲酚紫脂肪酶筛选培养基,对25株细菌进行平皿初筛,根据变色圈直径与菌落直径的比值,查选产脂肪酶的菌株；对产脂肪酶菌株进行摇瓶发酵,检测脂肪酶活性,进行复筛,确定一株产脂肪酶能力较高菌株；提取该菌株基因组,通过PCR技术获得该菌株16S rDNA序列,测序后经过序列同源性比对,构建系统发育树,发现与嗜冷杆菌属相似度达到99%,确定该菌株为嗜冷杆菌属,命名为Psychrobacter sp. ZY214。较佳产酶条件下的Psychrobacter sp. ZY214发酵液,通过40%-60%饱和硫酸铵分级盐析后获得沉淀,利用50 mM Tris-HCl (pH8.0)溶解沉淀后,采用Phenyl Sepharose FF疏水层析分离,得到SDS-PAGE电泳纯单一分离组分,活性检测为脂肪酶；LC-MS-MS质谱检测分子量为38.1 kDa,命名为Lip ZC12。Lip ZC12的最适反应温度为40℃,最适反应pH为8.0,Ca2+、Mg2+可以提高Lip ZC12的酶活力,Lip ZC12具有较强的有机溶剂耐受性,50% DMSO溶液中混合3小时,酶活性力保持95%左右。以对硝基苯基脂肪酸酯为底物,Lip ZC12的最适作用底物碳链长度为C12,Km值为13.1 mM,kcat值为1.20×103 S-1。利用脂肪酶三联体活性中心(Ser-Asp-His)和氧负离子洞(oxyanion hole)区域的保守序列引物3种OXF、4种ACR,组合为12种引物,以Psychrobacter sp. ZY214基因组DNA为模板,通过PCR方法进行脂肪酶基因片段扩增；通过保守序列PCR产物的测序结果与已知脂肪酶序列对比分析,确认Lip ZC12保守序列与Psychrobacter sp. JCM 18901脂肪酶前体具有相似性；利用Psychrobacter sp. JCM 18901作为参照基因组设计3对引物,通过PCR扩增获得脂肪酶全长基因,氨基酸序列与Psychrobacter sp. JCM18901脂肪酶前体相比,第32位I变为M,第182位N变为D。本论文筛选出一株产脂肪酶菌株,对嗜冷杆菌脂肪酶进行分离纯化以及基因、酶学性质表征。