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本论文以香港巨牡蛎(Crassostrea hongkongensis)为研究对象,利用构建了淋巴细胞盐度胁迫的差减杂交文库,对文库的ESTs测序结合RACE,成功的克隆出热休克蛋白90(ChHSP90),泛素融合蛋白(ChUbL40),两种超氧化物歧化酶(ChMnSOD,ChCuZnSOD),两种过氧化氢酶(ChCat-1,ChCat-2)以及肿瘤坏死因子受体相关因子7(ChTRAF7)共7条基因的全长cDNA序列。同时用荧光定量PCR技术(Real-time PCR)检测了这七种基因在正常香港巨牡蛎腮,外套膜,淋巴细胞,心脏,消化腺,肌肉,性腺等七个组织的表达规律,并检测了这些基因在弧菌感染后的表达变化和部分基因在盐度胁迫后的表达变化。
1.香港巨牡蛎热休克蛋白90(ChHSP90)基因cDNA全长为2459 bp,其中包含78 bp5’非编码区(UTR),215 bp3’非编码区(UTR)以及编码722个氨基酸的2166 bp的开放阅读框(ORF),同源性分析表明ChHSP90在进化中高度保守。在香港巨牡蛎的各种组织中都可以检测出ChHSP90 mRNA的表达。在淋巴细胞中,ChHSP90分别在高盐度胁迫后的第三天和低盐度胁迫后的第四天开始上调；在受到弧菌感染4h后,ChHSP90的表达量开始上调,但在6h时恢复到正常水平；但是8h后又开始上调,在36h时达到最高。这些结果表明ChHSP90在牡蛎防御盐度胁迫和细菌感染后起一定作用。
2.香港巨牡蛎泛素基因(ChUbL40)全长496 bp其中包括34 bp的5’UTR,75 bp的3’UTR,387 bpORF编码128氨基酸,并且高度保守。通过荧光定量PCR检测,ChUbL40在香港巨牡蛎的各个组织中广泛表达。在受到弧菌感染的淋巴细胞中,ChUbL40在表达量在前4h下调,从6h到24h逐步恢复到正常水平,表明了ChUbL40可能参与了牡蛎的免疫防御。
3.超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶都是重要的抗氧化酶,在本研究中,从香港巨牡蛎中克隆出两个SODs(命名为ChMnSOD和ChCuZnSOD)和两个过氧化氢酶基因(命名为ChCAT-1和ChCAT-2)。ChMnSOD和ChCuZnSOD基因的cDNA全长分别为997 bp和918 bp,其中ChMnSOD包含675 bp的ORF编码225氨基酸；ChCuZnSOD包含468 bp的ORF编码156个氨基。ChMnSOD和ChCuZnSOD在各个组织广泛表达,但ChMnSOD在性腺中表达量最高,而ChCuZnSOD在闭壳肌中表达量较高。在受到弧菌感染后,ChMnSOD在淋巴细胞中在4h时上调了5倍(P<0.05),在6h时恢复至正常。ChCuZnSOD的上调表达稍微滞后,在8h时上调了4倍,在12h时恢复到正常。两种SODs在受到弧菌感染的表达模式表明SODs可能在病害侵染过程中清除体内活性氧物质发挥重要的作用。ChCAT-1和ChCAT-2基因cDNA全长分别为1913 bp和2466 bp,ChCAT-1的ORF为1545 bp,编码515个氨基酸；ChCAT-2的ORF为1533 bp,编码511个氨基酸。并且它们的氨基酸序列中都包含一些过氧化氢酶的特征性序列:过氧化物激活位点,血红素链接序列,三个催化中心位点。系统进化分析显示,这两种过氧化氢酶可能来自同一个祖先基因的复制事件,并且该复制事情发生在香港巨牡蛎和太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)分化之前。ChCAT-1和ChCAT-2在香港巨牡蛎的中广泛表达,并且ChCAT-1和ChCAT-2在受到弧菌胁迫后表达量逐步上调,ChCAT-1在8h后上调了9倍,而ChCAT-2在12h上调了2.3倍。结果表明ChCAT-1和ChCAT-2在牡蛎的天然免疫中可能发挥了重要的作用。
4.肿瘤坏死因子受体相关因子7(TRAF7)是一种接头蛋白,介导了哺乳动物Toll样受体2的信号传导。香港巨牡蛎TRAF7(ChTRAF7)全长2290 bp编码686个氨基酸。其氨基酸序列包括一个RING指结构域,一个相邻的锌指结构及7个WD40重复结构,其结构在进化中高度保守。组织分布分析显示ChTRAF7在各个组织广泛表达,其中性腺的表达量最高。在受到弧菌胁迫后,ChTRAF7在淋巴细胞中的表达在4h和6h出现分别发生两次下调,说明ChTRAF7可能参与了牡蛎的天然免疫应答。
综上所述,本研究克隆了一批免疫相关基因,并且对其免疫感染后的表达模式进行了分析,这些研究结果有助于进一步了解香港巨牡蛎关于抵御细菌感染和盐度胁迫的分子免疫机制。此外,这些基因的发现丰富和发展了贝类分子免疫学的研究内容；对于全面了解和认识贝类免疫防御的分子机制,进而指导香港巨牡蛎的遗传改良和抗病品系的培育都具有重要的理论指导意义。