论文部分内容阅读
[目的]:大量研究发现青蒿素及其衍生物除具有抗肿瘤活性外,还能增加肿瘤的放疗敏感性,但其具体机制尚有很多未知的方面。本课题通过研究蒿甲醚(artemether,ARE)对放疗敏感人结直肠癌HCT116细胞及放化疗抵抗人结直肠癌HCT116-CRR (chemoradioresistant,CRR)细胞裸鼠移植瘤放疗效果的影响,并探讨其可能的作用机制是否与调控上皮-间质转化(epithelial mesenchymal transition,EMT)相关,为蒿甲醚作为结直肠癌放疗增敏药物提供实验依据。[方法] :1、建立人结直肠癌裸鼠移植瘤模型:培养放疗敏感人结直肠癌HCT116细胞及放化疗抵抗人结直肠癌HCT116-CRR细胞,按二代移植瘤接种的方法,分别建立BALB/c-nu裸小鼠人结直肠癌皮下移植瘤模型,待肿瘤长至约5 × 5 ×5mm3时,将各部分裸鼠随机分为四组,分别为对照组(Control)、蒿甲醚组(ARE)、放疗组(RT)、联合组(RT+ARE),按不同分组进行治疗;2、观察各组裸鼠的成瘤率、生存状态、体重变化等;3、隔日监测肿瘤长短径,计算肿瘤体积抑制率及增敏系数(efficiency factor,EF),绘制瘤体积变化曲线;4、治疗结束处死各组裸鼠取瘤块,称重并计算抑瘤率;5、通过流式细胞仪检测各组瘤组织的凋亡率及坏死率;6、取各组瘤组织10%甲醛固定,常规石蜡包埋、切片,HE染色,光镜下观察;7、免疫组化检测各组瘤组织中EMT相关因子E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist、β -Catenin 的表达情况;8、RT-PCR 检测各组瘤组织中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist、β-Catenin基因的表达水平;9、Western blot 检测各组瘤组织中 E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist、β -Catenin蛋白的表达水平;10、采用SPSS22.0软件进行数据统计分析,数据以均数±标准差(x±s)表示,满足方差齐性检验要求的数据采用方差分析,事后两两比较采用LSD-t检验;不满足方差齐性检验的数据采用Brown-Forsythe分析,事后两两比较采用Dunnett’s T3 检验。[结果]:1. HCT116及HCT116-CRR细胞裸鼠成瘤率为100%;各组间裸鼠体重无明显差异,治疗期间放疗组及联合组裸鼠活动明显减少,精神稍差。2. HCT116细胞各组裸鼠瘤体积治疗前无明显差异,治疗后联合组裸鼠瘤体积小于放疗组(P<0.05),联合组肿瘤体积抑制率91.66%明显高于放疗组88.13%,蒿甲醚对HCT116细胞裸鼠移植瘤的EF为3.20; HCT116-CRR细胞各组裸鼠瘤体积治疗前无明显差异,治疗后联合组裸鼠瘤体积小于放疗组(P<0.05),联合组肿瘤体积抑制率80.84%明显高于放疗组65.04%,蒿甲醚对HCT116-CRR细胞裸鼠移植瘤的EF为2.43。3. HCT116细胞联合组裸鼠平均瘤重小于放疗组(P<0.05),联合组抑瘤率91.20%明显高于放疗组88.83%; HCT116-CRR细胞联合组裸鼠平均瘤重小于放疗组(P<0.05),联合组抑瘤率83.84%明显高于放疗组67.24%。4. HCT116细胞联合组裸鼠瘤组织凋亡率(41.353±2.628) %大于放疗组(30.47±0.738)%(P<0.05),各组裸鼠瘤组织坏死率无明显差异;HCT116-CRR细胞联合组裸鼠瘤组织凋亡率(24.280±1.883) %大于放疗组(12.803±0.788) %(P<0.05),各组裸鼠瘤组织坏死率无明显差异。5.各组瘤组织HE染色后光镜下观察,HCT116细胞对照组裸鼠瘤组织中心可见明显的大片出血坏死液化区,坏死区域内有血细胞浸润,各治疗组裸鼠瘤组织坏死区域明显扩大,以联合组最为显著;HCT116-CRR细胞对照组裸鼠瘤组织可见部分肿瘤性坏死,肿瘤间质增生明显,各治疗组裸鼠瘤组织坏死区域有不同程度的扩大,以联合组显著。6.免疫组化检测各组裸鼠瘤组织中EMT相关因子的表达情况。HCT116细胞各组裸鼠瘤组织中,上皮标志物E-cadherin、β-Catenin呈强阳性表达,与放疗组比较,联合组表达上调;间质标志物N-cadherin在各组中呈阴性表达,Vimentin、Snail、Slug、Twist呈弱阳性表达,与放疗组比较,联合组表达下调。HCT116-CRR细胞各组裸鼠瘤组织中,上皮标志物E-cadherin在放疗组呈阴性表达,在联合组呈弱阳性表达,β-Catenin在各组中呈弱阳性表达,与放疗组比较,联合组表达上调;间质标志物N-cadherin、Slug在各组中呈弱阳性表达,Vimentin、Snail、Twist呈强阳性表达,与放疗组比较,联合组表达下调。7. RT-PCR检测各组裸鼠瘤组织中EMT相关因子的基因相对表达量。HCT116细胞联合组裸鼠瘤组织与放疗组比较,β-Catenin的基因表达量较放疗组升高(P<0.05),Vimentin的基因表达量较放疗组下降(P<0.05)。HCT116-CRR细胞联合组裸鼠瘤组织与放疗组比较,E-cadherin、β-Catenin的基因表达量较放疗组升高(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist 的基因表达量较放疗组下降(P<0.05)。8. Western blot检测各组裸鼠瘤组织中EMT相关因子的蛋白表达水平。HCT116细胞联合组裸鼠瘤组织与放疗组比较,β-Catenin的蛋白表达量较放疗组升高(P<0.05),Vimentin的蛋白表达量较放疗组下降(P<0.05)。HCT116-CRR细胞联合组裸鼠瘤组织与放疗组比较,E-cadherin、β-Catenin的蛋白表达量较放疗组升高(P<0.05),N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist 的蛋白表达量较放疗组下降(P<0.05)。[结论]:1. ARE联合放疗能显著抑制人结直肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤的生长,从而增强其放疗效果;ARE联合放疗能显著抑制人结直肠癌HCT116-CRR细胞裸鼠移植瘤的生长,从而增强其放疗效果,逆转其放化疗抵抗性;2. ARE联合放疗能促进人结直肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤的凋亡及坏死,从而增强其放疗效果;ARE联合放疗能促进人结直肠癌HCT116-CRR细胞裸鼠移植瘤的凋亡及坏死,从而增强其放疗效果,逆转其放化疗抵抗性;3. ARE联合放疗能上调人结直肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤上皮标志物β-Catenin的表达,下调间质标志物Vimentin的表达,提示ARE可能通过阻滞EMT增强人结直肠癌HCT116细胞裸鼠移植瘤放疗效果;4. ARE联合放疗能上调人结直肠癌HCT116-CRR细胞裸鼠移植瘤上皮标志物 E-cadherin、β-Catenin 的表达,下调间质标志物 N-cadherin、Vimentin、Snail、Slug、Twist的表达,提示ARE可能通过逆转EMT增强人结直肠癌HCT116-CRR细胞裸鼠移植瘤放疗效果,逆转其放化疗抵抗性;5. ARE能增强人结直肠癌裸鼠移植瘤放疗效果,可能成为一种低毒高效的放射增敏剂,应用于结直肠癌放射治疗当中。