背景：乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)感染可引起一系列肝脏疾病,包括无症状携带、慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)、肝硬化和肝癌。全世界有超过3亿人为慢性HBV感染,其中约三分之一在中国。在我国,每年因HBV感染相关肝病死亡的患者达30万人。目前尚无能彻底清除HBV的理想药物,因此HBV感染已经成为严重影响我国人民健康的公共卫生问题。HBV感染后肝细胞的损伤并不是由HBV的入侵、复制直接造成的,而主要是由宿主的免疫系统识别病毒感染细胞后引起的免疫杀伤。不仅如此,机体的免疫功能在很大程度上还决定了抗病毒治疗的效果。对抗病毒治疗无应答者,机体抗HBV免疫应答能力持续低下；而完全应答者其抗病毒免疫应答能力显著升高,即机体的免疫系统在HBV慢性感染的病程和转归中发挥重要作用。机体的免疫可分为天然免疫(亦称固有免疫或非特异性免疫)和适应性免疫(亦称获得性免疫或特异性免疫)两类。天然免疫是机体抵御感染的第一道防线,由物理、化学屏障(如皮肤、粘膜、胃酸等),吞噬细胞(巨噬细胞和中性粒细胞),体液因子(补体、溶菌酶、细胞因子等),NK细胞和NKT细胞等组成。天然免疫能非特异性识别并清除入侵的病原体,并在适应性免疫的启动、效应阶段发挥重要作用,还参与免疫应答的调节。在生理性免疫应答和某些病理性免疫过程中,天然免疫都处于关键环节。Invariant NKT (invariant NKT)细胞是天然免疫的重要组成细胞,最早于1987年在小鼠体内发现。invariant NKT细胞与传统T细胞的主要区别在于：①invariant NKT细胞的T细胞受体(TCR)比较保守,多样性高度受限。在小鼠主要为Vα14-Ja18/Vp8.2, Vβ7和Vβ2,在人主要为Va24-Jα18/Vp11。②与传统T细胞主要识别MHC分子递呈的抗原肽不同,invariant NKT细胞识别的是MHC I类样分子CD1d递呈的脂类或糖脂类抗原。③nvariant NKT细胞活化后能迅速(数小时内)分泌大量的Th1和Th2类细胞因子。invariant NKT细胞在外周血、淋巴结中比例很低,约占淋巴细胞的0.5%,但其在肝内却异常丰富,占肝内淋巴细胞的比例在小鼠高达40%,在人体也在12%左右。结构决定功能,肝内如此丰富的invariant NKT细胞在HBV慢性感染过程中发挥何种作用?HBV慢性感染是否对invariant NKT细胞的功能有影响?这种影响有何临床意义?在抗病毒治疗过程中,invariant NKT细胞的功能有何变化?对优化治疗方案有何意义?对于这些问题,目前的研究还未能给出清晰的答案。鉴于此,本研究比较了慢性HBV感染后不同疾病状态下患者外周血invariant NKT细胞的比例、表型及功能的变化；分析其与病毒复制和肝脏炎症的相关性；观察抗病毒治疗后这群细胞的变化规律；通过体外实验揭示invariant NKT细胞参与慢性HBV感染的潜在机制。方法：1.研究对象本研究共纳入35例CHB患者,其中一部分来自南方医院感染内科住院患者,一部分来自参加替比夫定抗病毒治疗的临床试验患者；15例免疫耐受期的HBV携带者(Immunotolerant Carrier,IT)和25例非活动性HBsAg携带者(Inactive Carrier, IC),主要为2009年12月至2011年4月南方医院感染内科门诊病人以及义诊患者；以及36例健康成人(Healthy Control, HC),主要为南方医院肝病中心实验室工作人员、在读研究生和南方医科大学学生2.血清学和病毒学检测用商品化的AxSYM MEI试剂盒(Abbott Laboratories, North Chicago, IL)检测乙肝两对半、抗-HCV和抗HDV。用罗氏Cobas Taqman48(Meylan, France)定量检测血浆中的HBV DNA,其最低检测下限为300拷贝/ml。此部分检测由南方医院肝病中心临床检测室完成。3.外周血单个核细胞(PBMC)的分离每例研究对象在入组时,用肝素钠抗凝管采集静脉血10-30ml。19例接受替比夫定抗病毒治疗的CHB患者在治疗后的第12周、24周和52周再另外抽取10-30ml静脉血。用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离PBMC。4.流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)用无菌PBS调整PBMC到合适浓度,转移至无菌流式管。加入荧光标记抗体,用FCM检测invariant NKT细胞的频数和相关受体的表达。在某些情况下,先用PMA对PBMC进行刺激,然后收集细胞,用胞内细胞因子染色检测invariantNKT细胞及其他细胞分泌细胞因子的情况。5.细胞迁移实验用Trans well系统检测趋化因子5(CCL5)和趋化因子20(CCL20)对invariant NKT细胞的趋化作用。将新鲜分离的PBMC置于上室,下室加入一定浓度的CCL5或CCL20,37℃培养10小时。收集上、下室的细胞,用FCM检测invariant NKT细胞的比。6.invariant NKT细胞体外增殖实验将新鲜分离的PBMC用RPMI1640完全培养基调整浓度至1×106个/ml,加入到96孔细胞培养板,200μl/孔。加入a-GalCer (invariant NKT细胞的特异性刺激剂)和重组人IL-21(rhIL-21),37℃细胞培养箱培养7天。收集细胞,用FCM检测invariant NKT细胞的增值情况。7. ELISPOT将新鲜分离的PBMC置于预先包被有鼠抗人IFN-γ的ELISPOT板,加入a-GalCer口rhIL-21,37℃细胞培养箱培养24小时。弃细胞,然后加入生物素标记的另一鼠抗人IFN-γ抗体,反应完成后再加入碱性磷酸酶标记的亲和素。加入底物显色,观察、记录结果。在某些情况下,用B细胞ELISPOT检测invariant NKT细胞活化对HBV特异性抗体产生的影响。具体步骤如下：ELISPOT板预包被重组HBeAg或HBcAg,然后加入PBMC,用a-GalCer刺激60小时。弃细胞,加入生物素标记的羊抗人IgG,37℃孵育1小时。洗涤后加入亲和素-碱性磷酸酶,加底物显色。8.肝内invariant NKT细胞的检测用无菌手术剪将新鲜切除的肝组织(来源于肝脏手术病人)剪成小块,加入组织消化液室温消化1小时。滤膜过滤,然后用人淋巴细胞分离液分离肝内淋巴细胞,FCM检测肝内invariant NKT细胞的比例。9.免疫组织化学染色将肝穿组织或手术切除肝组织经洗涤、脱水、透明、浸蜡后制成石蜡切片。用免疫组织化学染色检测肝内invariant NKT细胞的频数及分布。10.统计分析用GraphPad Prism5软件对实验结果进行统计分析。不同组间的结果比较用Mann-Whitney U检验。同一研究对象不同时间或剂量的比较用重复测量的方差分析。计数资料的比较用Fisher’s exact test。相关分析采用Spearman秩相关。用受试者工作特征曲线(ROC曲线)比较不同参数对替比夫定抗病毒治疗后HBeAg血清学转换的预测价值。双侧检验、P<0.05为统计学差异有显著性。结果：1.CHB患者外周血invariant NKT细胞比例显著下降我们首先比较、分析了invariant NKT细胞在CHB患者、HBV携带者以及健康人外周血中占CD3+T细胞的比例。结果显示,在健康成人外周血中,invariant NKT细胞占CD3+T细胞的比例中位数(最小值,最大值)为0.24%(0.064%-0.81%)。HBV感染后,在HBV特异性免疫还没起来的IT期,invariantNKT细胞比例升高至0.39%(0.203%-0.96%),显著高于健康对照(P<0.01)。在CHB患者,其HBV特异性免疫已被激发,外周invariant NKT细胞的比例下降至0.129%(0.027%-1.071%),显著低于IT(P<0.001),甚至比健康对照还要低(P=0.0143)。而在HBV受到免疫控制的IC期,invariant NKT细胞的比例得到一定恢复,为0.19%(0.06%-1.38%),显著高于CHB患者(P=0.0235),虽然比健康人略低,但没有统计学意义,也要显著低于IT(P<0.001)。2.IT期CD4-invariant NKT细胞的比例与病毒载量呈正相关我们对30例CHB患者进行Spearman秩相关分析,结果显示,invariant NKT细胞占CD3+T细胞的比例与血浆中的病毒滴度和ALT水平并没有明显的相关性。进一步将invariant NKT细胞分为CD4-和CD4+两个亚群分析,在IT期,HBV DNA滴度与CD4-NKT细胞的比例呈明显的正相关(r=0.928,P=0.008),而与CD4±invariant NKT细胞比例和总的invariant NKT细胞比例无明显相关性。3.替比夫定抗病毒治疗后外周血invariant NKT细胞的比例升高19例CHB患者在抗病毒治疗前(Baseline)其外周血invariant NKT细胞占CD3+T细胞的比例为0.18%(0.03%-1.07%)；接受抗病毒治疗后的12W,比例为0.21%(0.04%-1.43%),显著高于Baseline(P=0.0231)；治疗24w后,比例为0.20%(0.04%-1.49%),高于Baseline,但没有统计学意义(P=0.08)；治疗52w后,invariant NKT细胞占CD3+T细胞的比例为0.21%(0.05%-1.22%),也是显著高于Baseline的(P<0.01)。治疗后12W、24W和52W之间互相是没有显著性差异的。4.CHB患者基线invariant NKT细胞亚群比例能预测替比夫定治疗52W后e抗原血清学转换在19例接受替比夫定抗病毒治疗的CHB患者中,有7例(36.84%)在治疗52W后发生了e抗原血清学转换。在治疗过程中,无论转换组还是非转换组,患者血浆中的HBV DNA滴度都是下降的,但两者下降的趋势不一样。非转换组在治疗后的前12W,病毒滴度快速下降至4-5log,然后在这个较高的病毒水平上维持相对的稳定。而转换组在治疗后的前12W,病毒滴度快速下降至3-4log,然后随着治疗时间的延长,病毒滴度继续下降至3个log以下。统计结果显示,在替比夫定抗病毒治疗后的24W和52W,转换组的HBV DNA水平是显著低于非转换组的(12W,P<0.05,52W,P<0.01)。在基线,转换组的ALT水平(U/L)为188.9±78.17,虽然高于非转换组(128.2±98.84),但由于例数较少,并没有统计学意义(P=0.1082)。抗病毒治疗后,无论是转换组还是非转换组,其血清ALT水平都是持续下降的。把19例接受替比夫定抗病毒治疗的患者按基线CD4-/CD4±invariant NKT细胞的比值分成两组：高比例组(≧1)和低比例组(<1)。然后比较两组抗病毒治疗52W后e抗原血清学转换情况。结果显示,高比例组(n=12)中有7例(58.33%)发生了血清学转换,显著高于低比例组。ROC曲线下面积为0.75(95%CI,0.502-0.917),能用于预测治疗52W后的e抗原血清学转换(P=0.04)。CD4-/CD4±invariant NKT细胞比值在0.94时具有最好的预测效果(敏感性100%,特异性58.6%)。5.活化的invariant NKT细胞能促进e抗体分泌细胞的产生用a-GalCer刺激新鲜分离的PBMC(来自于IC携带者),用ELISPOT检测其对e抗体分泌细胞产生的影响。结果显示,不加a-GalCer刺激时,有2例(40%)IC可以用ELIPOT检测出e抗体分泌细胞；加入100ng/ul a-GalCer刺激60h后,有4例(80%)可检测出e抗体分泌细胞,且前面俩例不加a-GalCer刺激也能检测出的在加了a-GalCer刺激后,e抗体分泌细胞的数量也是增多的。统计结果也显示a-GalCer刺激能显著增加IC携带者PBMC中e抗体分泌细胞的产生(P<0.05)。我们还用雅培AxSYM MEI kits半定量检测了a-GalCer刺激60h后的上清中e抗体的水平,发现5份样本中只有一份检测结果为阳性。6.IL-21能抑制a-GalCer对invariant NKT细胞的增值我们前期的研究结果显示,CHB患者外周血中invariant NKT细胞的比例是降低的,而血清中IL-21浓度是升高的。考虑到invariant NKT细胞是IL-21重要的分泌细胞,我们推测IL-21浓度的升高可能会反馈抑制invariant NKT细胞的增值。我们用a-GalCer在体外刺激新鲜分离的CHB患者的PBMC,7天后收集细胞,流式检测invariant NKT细胞的比例。结果显示其比例为0.59±0.28%,明显高于未刺激组(0.28±0.18%,P<0.05)。如果在加入a-GalCer刺激的同时,加入终浓度为100ng/mlrhIL-21,刺激7天后,invariant NKT细胞的比例为0.25%±0.17%,显著低于a-GalCer单独刺激组(P<0.05),但与未刺激组相比无明显差异。收集培养上清,用FlowCytomix检测Th1和Th2细胞因子的浓度。不加IL-21刺激,上清中IL-10的浓度为23.87±14.96pg/ml,IL-6的浓度为577.2±892.9pg/ml,IL-1β的浓度为18.92±4.16pg/ml o10ng/ml的IL-21刺激后,上清中IL-10的浓度为109.54±21.31pg/ml,显著高于未刺激组(P<0.05)；IL-6的浓度为1467.5±680pg/ml,显著高于未刺激组(P<0.05)；IL-1β的浓度为50.13±28.444pg/ml,显著高于未刺激组(P<0.05)。100ng/ml IL-21刺激后,上清中IL-10的浓度为378±266.9pg/ml,显著高于未刺激组(P=0.0022)和lOng/ml IL-21刺激组(P<0.05)；IL-6的浓度为5640±1165pg/ml,显著高于未刺激组(P=0.0087)和10ng/ml IL-21刺激组(P<0.05)；IL-1β的浓度为315.8±142.4pg/ml,显著高于未刺激组(P=0.0095)和10ng/ml IL-21刺激组(P<0.05)。IL-21刺激后,TNF-a的浓度也有升高,但无统计学差异。我们用FlowCytomix还检测了培养上清中IL-12p70、IFN-γ、IL-2、IL-8、IL-4、IL-5和TNF-β的浓度,发现IL-21刺激组和未刺激组间无明显差异。结论：1.我们的横向研究结果显示外周血invariant NKT细胞的比例在慢性HBV感染中有一个升高、降低、恢复的过程,表明invariant NKT细胞参与了慢性HBV感染的免疫学发病机制,且与病毒复制和肝内炎症相关。2.CHB患者外周血invariant NKT细胞比例的降低可能与其高表达CCR5和CCR6相关,即因肝内炎症而产生的大量趋化因子招募invariant NKT细胞进入肝内。3invariant NKT细胞具有异质性,而CD4-和CD4+invariant NKT细胞的比值可作为预测CHB患者替比夫定治疗52周后e抗原血清学转换的一个潜在指标。