牙鲆(Paralichthys olivaceus)prdm14和prdm1基因的克隆与表达分析

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牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖经济鱼类之一。多年来,中国、日本、韩国等国家的科研人员不遗余力地对牙鲆进行了品种改良等研究工作,取得了很好的成绩。然而,如何保存优质的种质资源是尚待解决的一个关键问题。随着干细胞等相关研究的深入,鱼类干细胞、诱导性多能干细胞(iPSCs,induced pluripotent stem cells),原始生殖细胞(PGC,primordial germ cells)等逐渐引起人们的注意。由于prdm14基因在干细胞中起到维持细胞干性的作用,而且prdm14和prdm1基因在PGC的特化过程中也发挥着非常重要的作用。因此研究牙鲆prdm14和prdm1基因对于种质资源的保护具有重要意义。本文克隆并分析了牙鲆prdm14和prdm1基因,为下一步深入研究奠定了基础。  牙鲆prdm14基因全长5881 bp,由九个外显子和八个内含子组成,cDNA全长2623 bp,其中5UTR区长度为214bp,3UTR区长度为576bp,ORF长度为1833 bp,预计编码610个氨基酸,含有PRDM家族特有的PR结构域以及六个锌指结构。多序列蛋白比对分析、基因结构分析以及系统进化树分析显示,得到的牙鲆PRDM14蛋白与哺乳动物PRDM14蛋白同源。我们还得到了1929 bp的prdm14基因启动子序列,对其进行生物信息学分析,发现很多转录因子结合位点与已知的prdm14基因在哺乳动物中的功能相关。这些结合位点可能预示着牙鲆prdm14基因与哺乳动物prdm14基因有着相似的功能,即原始生殖细胞特化、干细胞状态维持等方面的功能。胚胎荧光定量PCR和原位杂交结果显示牙鲆prdm14基因在桑椹胚到原肠晚期之间有较高的表达,其中在原肠早期牙鲆prdm14基因的表达量达到顶峰。牙鲆性腺组织切片原位杂交结果显示,在卵巢中prdm14基因定位于各发育阶段的卵母细胞中,且只在细胞核中表达;在精巢中,prdm14基因仅在精原细胞中表达,在精母细胞中没有信号。  牙鲆prdm1基因由七个外显子和六个内含子组成,其cDNA全长为4406bp,其中5,UTR长度为128bp,3UTR长度为1746bp,ORF长度为2532 bp,prdm1基因编码843个氨基酸,含有PRDM家族特有的PR结构域以及五个锌指结构。多序列蛋白比对分析、基因结构分析以及系统进化树分析显示,得到的牙鲆PRDM1蛋白与哺乳动物PRDM1蛋白同源。此外,我们还得到了3216 bp的牙鲆prdm1基因启动子序列并进行分析,预测潜在的转录因子结合位点,发现这些转录因子多与免疫、性别分化等功能相关。胚胎发育时期荧光定量PCR和原位杂交结果显示,牙鲆prdm1基因为母源性表达,在原肠中期表达量达到顶峰。成体组织荧光定量PCR结果显示,prdm1为泛表达基因,这与它功能的多样性是吻合的。牙鲆性腺组织切片原位杂交结果显示,在卵巢中,prdm1基因定位于各发育阶段的卵母细胞中,且在细胞核和细胞质中都有表达;在精巢中,prdm1基因仅在精原细胞中表达,在精母细胞中没有信号。
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