目的急性呼吸窘迫综合症（ARDS）,是严重的急性肺损伤（ALI）,以微血管的通透性增加,严重的低氧血症,弥漫性的肺侵润为特点,其临床病死率可以达到40-50%。ALI与肺水肿有关,而肺水肿与水的转运有关,水的转运出现于围生期,参与小儿肺水的快速吸收,成人的气道水化,以及与肺损伤有关的液体的积聚与吸收。有研究表明,水通道蛋白（AQPs）,作为一种水通道,在肺的生理和病理生理过程中可能具有重要的作用。AQP5被发现于Ⅰ型肺泡上皮细胞的顶膜,在急性病毒感染的肺中,AQP5的表达下降,AQP5的缺失产生肺泡毛细血管水通透性的10倍的下降,也显示AQP5在肺水的聚积中具有一定的作用。不同种类的动物中,β肾上腺素能受体激动剂对于肺泡液体的清除（AFC）效应是不同的。在鼠肺,特布他林、异丙肾上腺素和沙美特罗作为有力的β₂受体激动剂,促进肺泡液体的清除。多巴酚丁胺作为一种β肾上腺素能受体激动剂,能够刺激在体的鼠肺的肺泡液体的清除,并且能够被选择性的β₂受体拮抗剂ICI-118551所拮抗。cAMP能够影响肺泡上皮细胞的AQP5的分布和丰度,而cAMP又受到β受体激动剂的调节。上述研究提示,多巴酚丁胺可能增加cAMP和AQP5的表达,促进肺泡液体的清除。本研究探讨了多巴酚丁胺对急性肺损伤大鼠的肺泡液体清除率（AFC）以及水通道蛋白5（AQP5）及环磷酸腺苷（cAMP）表达的影响。实验材料1、实验动物健康Wistar大鼠64只,雄性,体重（3-4月龄,300-350g）,中国医科大学附属盛京医院实验动物中心提供。2、实验试剂戊巴比妥钠（上海化学试剂采购供应站）;多巴酚丁胺（上海第一生化制药）;大肠杆菌内毒素LPS（Escherichia coli）（Sigma,USA）;EVANS蓝（Sigma,USA）;水通道蛋白5抗体（Anti-aquaporin 5）andβ肌动蛋白抗体（anti-β-actin）（AlphaDiagnostic International,USA）;Trizol（Invitrogen,USA）;AQP5 andβ-Actin cDNAPrimers（Shanghai Genebase Gen-Tech Ltd,China）;RT-PCR试剂盒（Promega,美国）;聚偏二氟乙烯（PVDF）蛋白印迹膜（Bio-Rad,美国）;逆转录酶、PCR所需酶和其他试剂（Takara公司,日本）;PBS等其他试剂为国产3、主要实验仪器（1）小型动物呼吸机（Harvard638型,美国）（2）超低温冰箱（SANYO MDF-U,日本）（3）烘箱（上海跃进）（4）水浴箱（上海跃进医疗器械厂）（5）分光光度仪（岛津公司,日本）（6）微量输液泵（JMS,美国）（7）水平板电泳系统（BIO-RAD sub-cell GT,美国）（8）通用电泳仪（BIO-RAD PowerPac200,美国）（9）台式低温高速冷冻离心机（Sigma 3K30,美国）（10）压力换能器（Edwards LifeSciences,美国）（11）自动电泳凝胶成像分析仪（Alphainnotech Chemilmager,美国）（12）小型垂直电泳仪（Bio-Rad Mini-ProteinⅢ,美国）（13）半干转印仪（Bio-Rad Seimidry transfer system,美国）（14）自动封膜仪（江苏仪器设备公司,中国）（15）HEIDOLPH DIAX900型匀浆机（德国）（16）PTC-100型PCR扩增仪（美国）（17）GLS-700D型数码凝胶扫描分析系统（上海,中国）（18）A-200Ds电子天平（美国）（19）超纯水转装置（MILLIPORE MILLI-Q,美国）（20）实验室制冰机（ZIGERA 2BE-70-35,德国）（21）恒温震荡培养箱（GFL,德国）（22）小型台式离心机（SIGMA 1-13,美国）（23）PH计（WTW InoLab,德国）（24）电动高压消毒锅（HIRAYAMA HVE-50,美国）（25）倒置相差显微镜（OLYMPUS,日本）（26）JUNG-CM1800型切片机（上海）（27）VITRO1250血液生化自动分析仪（美国）（28）惠普监测仪（美国）实验方法本研究通过静脉注射内毒素制作ALI的模型,通过持续静脉泵入多巴酚丁胺作为干预措施,机械通气120分钟后,通过分光光度仪,在波长620nm处测定Evans蓝标记的白蛋白浓度来测定不同组大鼠的肺泡液体清除率（AFC）;应用Western-blot,测定大鼠肺组织水通道蛋白5（AQP5）的表达;应用RT-PCR的方法测定大鼠肺组织AQPSmRNA的含量;通过放射免疫的方法测定肺组织中环磷酸腺苷（cAMP）的含量;比较各组数据之间的差异性。动物模型制备:大鼠称重,腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉,仰卧位固定。气管切开置入气管插管,接动物呼吸机。容量控制通气,潮气量10ml/kg,呼气末正压3cmH₂O（1cmH₂O=0.098kPa）,呼吸频率35～50次/min,吸入氧浓度（FiO2）100%。调节呼吸频率,保持动脉血二氧化碳分压35～50 mmHg（1mmHg=0.133kPa）。维持动脉收缩压90～130mmHg,心率260～300次/min。分离股动、静脉,分别置入血管导管。静脉注射内毒素10 mg/kg,复制急性肺损伤模型。分组情况:按随机数字法将动物分为4组,正常对照组（实验开始时静脉注射等量生理盐水,Saline组）、多巴酚丁胺对照组（实验开始时静脉持续注射多巴酚丁胺10μg/kg/min,Saline+Dobu组）,前两组为非ALI组;急性肺损伤组（实验开始时静脉注射内毒素10mg/kg,LPS组）、多巴酚丁胺治疗组（实验开始时静脉注射内毒素10mg/kg后,静脉持续注射多巴酚丁胺10μg/kg/min,LPS+Dobu组）,为ALI组。循环稳定20～30 min后,开始实验（0h）。实验结束（120分钟）,用腹主动脉放血法处死大鼠,取材。结果1、多巴酚丁胺对肺损伤大鼠的肺泡液体清除率（AFC）的影响。在LPS组,肺泡液体清除率（AFC）是15.8±2.61%,而LPS+Dobu组的肺泡液体清除率（AFC）是25.2±3.5%。与LPS组相比,持续静脉内注射多巴酚丁胺能够显著的提高肺泡液体清除率（AFC）70%（Fig1 A）,p＜0.01,在非ALI的Saline组和Saline+Dobu组,多巴酚丁胺对肺泡液体清除率（AFC）的影响并无差异（Fig1B）。2、多巴酚丁胺对AQP5 mRNA和蛋白表达的影响RT-PCR显示,在LPS组AQP5 mRNA水平与β-Actin比值为0.03±0.0022,而LPS+Dobu组是0.41±0.01,LPS+Dobu组的AQP5 mRNA的表达水平是对照组的13倍,p＜0.01(Fig 2A,通过Western-blot也证实,在LPS+Dobu组AQP5的蛋白表达显著升高（Fig 2C）;而在非ALI的Saline组和Saline+Dobu组相比较,无论在基因水平还是在蛋白表达水平均无差异（Fig 2B,2C）,Western-blot定量分析也证实了上述结果（Fig2D）。3、多巴酚丁胺对肺损伤大鼠肺组织的cAMP的表达。cAMP含量在LPS组大鼠肺组织的表达是22.3±7.6pmol/mg,而LPS+Dobu组是237.9±32.1pmol/mg。多巴酚丁胺显著增加肺损伤大鼠的肺的cAMP的表达,LPS+Dobu组是LPS组的7倍,p＜0.01（Fig3A）。而在非ALI组多巴酚丁胺亦增加肺的cAMP的表达,但是SNine+Dobu组是Saline组的2倍,p＜0.01,（Fig3B）。讨论大多数的ALI和ARDS的病人的肺泡液体清除功能受到损害,而良好的肺泡液体的清除往往提示着良好的预后。众所周知,β肾上腺素能激动剂能够刺激肺泡上皮细胞钠的转运和水的清除。作为一种临床广泛应用的β肾上腺素能激动剂,多巴酚丁胺能够增加机械通气大鼠的肺泡液体的清除,我们的研究首次提示,在内毒素所致的肺损伤大鼠的模型中,多巴酚丁胺可能通过调节AQP5表达和cAMP含量来增加肺泡液体清除率。AQP5对ALI后肺泡液体清除率（AFC）的影响尚存在争议。有研究认为,AQP5参与了ALI/ARDS异常的水的转运,参与了肺水肿的形成,而另一些研究则显示了负相关。在此,我们认为,在LPS+Dobu组肺损伤大鼠,AQP5蛋白表达的上调与多巴酚丁胺的处理有关。我们知道,AQP5对气道粘膜下腺体的分泌有重要的影响,然而,虽然AQP5对氯和钠的转运最初在囊性纤维化的研究中发现,但其分子层面的机制并不清楚。cAMP调节水通道蛋白的最明确的例子是肾脏细胞的水通道蛋白2（AQP2）,而在水通道家族,AQP5的遗传学特征与AQP2是最接近的。也有报道,cAMP调节肺泡上皮细胞AQP5的分布和浓度,而cAMP的水平受到β肾上腺素能激动剂的调节。短期（数分钟）暴露与cAMP,会产生AQP5的内在关闭和细胞膜上丰度的下降,而长时间的暴露于cAMP则增加AQP5的分布与丰度。上述反应均可被蛋白激酶A的抑制剂所阻断。在我们的研究中,我们观察到持续多巴酚丁胺处理2小时后cAMP的水平升高,显示多巴酚丁胺诱导了在体的cAMP的表达,这种多巴酚丁胺对cAMP-AQP5的调节作用,对于临床ALI的治疗可能具有重要的作用。我们的研究显示,在内毒素所致的肺损伤大鼠的模型中,持续静脉注射多巴酚丁胺能够增加AFC,增加AQP5和cAMP的表达,提示多巴酚丁胺对肺水清除（AFC）的影响可能通过cAMP和AQP5来完成,对上述机制的进一步的研究,可能为ALI的进一步的靶向治疗提供帮助。结论在内毒素所致的急性肺损伤大鼠的模型中,持续静脉注射多巴酚丁胺能够增加肺泡液体的清除率（AFC）,减少肺水含量;同时也增加AQP5和cAMP的表达,提示多巴酚丁胺对肺水清除（AFC）的影响可能通过AQP5和cAMP来完成。