动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）作为心血管疾病始动因素之一,其特征是慢性炎症贯穿疾病的各个阶段。越来越多的证据表明,机体中活性氧（Reactive oxygen species,ROS）在AS的发生发展中起到重要作用。受限于低利用率和毒性副作用,以药物为主的AS治疗尚需拓展,亟需开发出更有效的药物或策略以突破当前的瓶颈。近年来,具有ROS清除能力的纳米材料的出现为动脉粥样硬化的治疗提供了新思路。其中,铈纳米材料已被证明具有显著的抗炎、抗ROS作用,并已被逐渐应用于各类炎性疾病的治疗研究。鉴于此,本文报道了一种基于特殊分子介导自组装铈纳米酶药物用于抗动脉粥样硬化的新策略。由于有机分子和无机元素之间的相互作用是历来研究纳米材料的技术瓶颈,为解决此问题,我们创新性地筛选出唑来膦酸（ZOL）作为功能连接分子,利用双膦酸和咪唑基团对铈及相关金属离子的高锚定能力,成功构建了一种尺寸均一、酶学活性丰富、类似金属有机框架的铈纳米酶（CZNCs）材料;将抗AS药物普罗布考（PB）共组装于一体并采用血小板膜包裹,构建得到仿生化的铈纳米酶药物（PCZ@PB NCs）;最后将其应用于具有氧化应激及炎性微环境的AS改善作用研究。体外和体内实验均表明,PCZ@PB NCs不仅能有效靶向蓄积到动脉粥样硬化的炎性病灶,还能协同调节微环境的ROS和炎症因子表达水平,抑制泡沫细胞的形成,从而有效改善斑块面积大小及其病理微环境,达到抗动脉粥样硬化的目的。总之,本研究提供了一种通用的组装技术来获得具有多功能酶活性和药物递送能力的仿生化纳米药物,用于氧化应激和炎症性疾病的治疗。目的构建一种基于特殊分子介导铈纳米酶的通用载药体系,探究其自组装、多种药物加载的能力,并评价其多功能酶学活性;继而通过血小板膜修饰构建仿生化纳米酶药物,探究其抗AS的靶向协同药理作用,为其潜在治疗功能提供新的思路和方法。为其进一步在生物医学领域的应用奠定了一定的理论和实验基础。方法1、特殊分子配体介导自组装铈纳米酶的制备与表征:为了探究小分子介导铈纳米酶自组装的可行性,考虑到双膦酸和咪唑基团对铈离子的配位锚定作用,首先选择阿仑膦酸（AL）和二甲基咪唑（HMIM）的双配体体系与铈离子自组装得到双配体铈纳米复合物（CHA）。为了简化合成环境,将结构中同时含有咪唑和双膦酸基团的特殊分子ZOL作为有机连接分子与铈离子自组装,得到单配体铈纳米酶（CZNCs）。对CHA、CZNCs的理化性质以及组装机理进行表征2、仿生化铈纳米酶药物（PCZ@PB NCs）的合成与表征:为了提升CZNCs的治疗作用,CZNCs和PB通过一步法组装得到铈纳米酶药物（CZ@PB NCs）。为了赋予CZ@PB NCs靶向能力和提升生物相容性,对其进行外部仿生化修饰。即根据文献报道的方法获取血小板膜,通过超声处理对CZ@PB NCs进行包被得到仿生化铈纳米酶药物（PCZ@PB NCs）。对CZ@PB NCs和PCZ@PB NCs的合成以及理化性质进行表征。3、PCZ@PB NCs的体外抗AS活性研究:通过CCK-8法验证PCZ@PB NCs对这三种细胞活力的影响。通过流式细胞仪评价PCZ@PB NCs分别被小鼠巨噬细胞（Raw 264.7）和炎性Raw 264.7细胞摄取的能力,以及在Raw 264.7细胞中的摄取方式。通过ROS试剂盒染色后荧光显微镜和流式细胞仪验证PCZ@PB NCs清除ROS的能力,并通过WB评价PCZ@PB NCs的抗炎作用。采用油红O（ORO）染色验证PCZ@PB NCs抵抗氧化低密度脂蛋白刺激Raw 264.7细胞泡沫化的能力。4、PCZ@PB NCs的体内抗AS作用研究:通过高脂喂养载脂蛋白E基因敲除(Apolipoprotein E knockout,Apo E-/-)小鼠建立AS模型。在尾静脉注射荧光标记的PCZ@PB NCs后,采用小动物活体成像仪和ICP-MS收集其在主动脉和主要器官的分布情况。通过ORO染色纵切主动脉以及主动脉弓、主动脉根和头臂动脉冷冻切片,结合主动脉根组织学和免疫组织化学评价PCZ@PB NCs的抗AS作用。采用全自动生化分析仪对给药后小鼠血液进行血液生化指标分析,并对主要器官切片进行病理学检测。结果1、特殊分子介导自组装铈纳米酶的制备与表征:通过合成条件优化合成澄清透明的、尺寸均一（10 nm）球型铈纳米酶CHA并具有一定的装载能力。将铈离子与ZOL组装后的合成条件优化表明硝酸铈的浓度为5 m M时可得到稳定均一、平均尺寸10 nm的CZNCs球状纳米粒子。CZNCs具有良好的装载递送潜力,每个铈离子周围通过双膦酸-铈离子和咪唑-铈离子形成6配位骨架结构。2、PCZ@PB NCs的合成与表征:抗氧化药物PB与CZNCs共组装获得CZ@PB NCs。与CZNCs相比,TEM、AFM显示CZ@PB NCs具有清晰的球形结构,粒径从10nm增加到25 nm,水合粒径尺寸也从15 nm增加到40 nm。CZNCs和CZ@PB NCs都具有铈离子-咪唑基团和Ce-O的典型IR吸收峰。通过血小板膜仿生化修饰构建PCZ@PB NCs,TEM和双氧铀负染TEM结果显示,血小板膜的包封改善了CZ@PB NCs的分散性,并且出现了典型“核-壳”结构,外部膜厚度约为3 nm。相比于CZ@PB NCs,由于膜负电荷压缩作用,PCZ@PB NCs的流体动力学尺寸在膜封装后略微减小到约35 nm。PCZ@PB NCs具有良好的CAT和SOD模拟活性和血红细胞安全性。3、PCZ@PB NCs的体外抗AS活性研究:CCK-8实验证明,PCZ@PB NCs即使在铈离子浓度高达400μM对三种细胞的活力未见显著影响,仿生化修饰后细胞安全性得到提升。PCZ@PB NCs可以被Raw 264.7有效摄取,且更易被炎性Raw 264.7细胞内化,在细胞内通过溶酶体途径转运。荧光显微镜、流式细胞仪和WB分析均表明CZNCs、CZ@PB NCs和PCZ@PB NCs能够有效清除细胞内ROS,通过显著降低p65蛋白磷酸化水平,下调促炎因子肿瘤坏死因子-α、基质金属蛋白酶-9表达水平。ORO染色细胞内脂滴显示PCZ@PB NCs减少ORO染色面积最为显著,抑制了氧化低密度脂蛋白介导的泡沫细胞形成。4、PCZ@PB NCs的体内抗AS研究:荧光成像结果和ICP-MS量化分析表明经过仿生化修饰的PCZ@PB NCs在AS模型小鼠主动脉中的蓄积相较CZ@PB NCs显著提高。此外,PCZ@PB NCs在肝脏中的分布最多。相比生理盐水处理组、游离PB组,PCZNCs、CZ@PB NCs组的主动脉ORO染色区域减小;主动脉根、主动脉弓和头臂动脉的ORO染色冷冻切片表明铈纳米酶能够抑制斑块的进展;而PCZ@PB NCs组的坏死核心面积显着降低;Masson三色染色显示PCZ@PB NCs治疗组斑块周围的胶原蛋白含量较高。此外,抗CD68抗体和抗MMP-9抗体染色表明PCZ@PB NCs处理可有效降低巨噬细胞浸润和斑块中MMP-9的表达。结论总之,本论文提出了一种具有通用性的独特小分子配体ZOL与金属离子的自组装策略。在此基础上,开发了一种多功能酶活性和药物递送仿生铈纳米酶药物PCZ@PB NCs用于动脉粥样硬化治疗。PCZ@PB NCs不仅能够有效靶向到动脉粥样硬化炎症病变,还协同药物调节ROS水平,抑制泡沫细胞形成实现抑制AS进程,并表现出良好的生物相容性。一方面,为拓展铈纳米材料的生物医学应用提供了新思路。另一方面,除了动脉粥样硬化外,这种具有ROS清除效应的铈纳米酶针对其他炎症性疾病具有广泛的协同药物开发潜力。