骨髓间充质干细胞（BMSCs）是治疗括约肌功能障碍型（ISD）压力性尿失禁的理想细胞，临床上把BMSCs移植到尿失禁患者的尿道周围，希望通过成体组织细胞对BMSCs的诱导，使干细胞发生向相应成体细胞的分化，以治疗受损肌肉的排尿功能障碍。然而，至今为止该疗法并没有获得预期的疗效，究其原因是BMSCs诱导分化的机制研究较少，很多关键性的问题没有解决直接影响着干细胞在临床上的治疗效果。前期的一些实验中可以观察到在体外膀胱平滑肌细胞的微环境中BMSCs可向平滑肌细胞的表型分化，提示参与干细胞定向分化的信号可能存在于干细胞生存的微环境中,通过相应的信号转导通路,启动干细胞的基因在时空上特异性表达,合成特异性蛋白质,从而使细胞在功能、结构等方面发生不同改变。微环境之所以能够精密的调控干细胞向特定细胞分化，关键因素就是干细胞对其微环境的适应性以及微环境对干细胞的潜在影响。因此，针对干细胞在微环境中的适应性对于全面及清楚的认识干细胞分化情况具有非常重要的理论意义，但是到目前为止，与干细胞微环境适应性有关的具体机制仍不清楚。因此研究干细胞在体内外微环境诱导下的适应性的调控变化及机制显得十分重要。近几年来组蛋白乙酰化修饰对干细胞分化的影响引起了人们广泛关注，组蛋白乙酰化可能是干细胞微环境适应性中重要的胞内信号调控事件，染色质核小体组蛋白可以通过共价修饰而发生乙酰化、甲基化和磷酸化,其中与特异性基因转录调控关系最为密切的是组蛋白的乙酰化修饰，通过染色质水平调节DNA构型疏密，并由染色质不同位点组蛋白的乙酰化修饰构成了多种多样的“组蛋白密码”。一般而言，乙酰化的染色质与基因转录激活有关，相反的，去乙酰化的染色质与基因转录抑制相关，启动子附近的组蛋白乙酰化水平升高可影响多种生物的可诱导基因的转录起始。因而在真核细胞中，组蛋白乙酰化/去乙酰化对染色质结构及基因转录的调控是一个多层次、多步骤的复杂过程。本实验取材于3周龄雌性SD大鼠，分别采用密度梯度离心法和胶原酶消化法，分离培养了BMSCs和BSMCs；并模拟体内盆底环境，体外构建膀胱平滑肌与BMSCs接触培养体系，建立间充质干细胞向平滑肌细胞分化模型，旨在研究组蛋白乙酰化修饰在BMSCs向平滑肌分化的意义以及膀胱平滑肌微环境诱导BMSCs适应性的调控机制，主要实验方法及结果如下：一、细胞培养鉴定与共培养模型的建立1.大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）的分离与培养无菌操作下取3周龄雌性SD大鼠双侧股骨、胫骨，DMEM-F12培养基反复冲洗骨髓腔，冲洗液混匀，梯度密度离心弃上清后提取沉淀，加入含10%FBS的DMEM-F12培养液中，置37℃的5%CO2培养箱中培养。所得第三代贴壁细胞经流式细胞仪检测其分子表型。结果：成功的分离出形态为梭形的骨髓间充质干细胞，其分子表型为：CD31、CD45阴性、CD29、CD44、阳性。2.大鼠膀胱平滑肌细胞（BSMCs）的分离与培养无菌操作条件下取3周龄雌性SD大鼠膀胱，采用胶原酶消化法分离膀胱平滑肌细胞，用含10%FBS的HG-DMEM培养，所得贴壁细胞，免疫荧光法鉴定其标志蛋白的表达。结果：平滑肌标志基因a-SMA, Calponin和SM-MHC均表达阳性。3.建立大鼠膀胱平滑肌微环境诱导BMSCs体外分化模型BMSCs和膀胱平滑肌细胞分别种在悬挂式细胞培养小室transwell多孔膜（1um）两侧，cell culture inserts放入六孔板中作为实验组，以未经过共培养的同代同批次BMSCs作为对照组。收集接触共培养4日后的BMSCs，RT-PCR、Western Blot、及免疫荧光检测实验组与对照组成肌分化后平滑肌标志性蛋白。结果：RT-PCR、Western Blot、及免疫荧光结果显示实验组较对照组的BMSCs中平滑肌标志性蛋白的表达量显著增加，说明BMSCs在平滑肌微环境中成肌分化，建模成功。二、组蛋白乙酰化对BMSCs向BSMCs分化的影响1.微球菌核酸酶实验检测BMSCs分化前后平滑肌标志性基因启动子区染色质开放性，将第三代BSMCs接种于培养小室transwell下室面，放入培养箱中培养6h后将翻转过的transwell放入含平滑肌培养液的六孔板中继续培养。次日将BMSCs接种于膜内面。分别收集共培养3天的实验组与对照组BMSCs，PCR检测进行不同时间微球菌核酸酶处理的实验组与对照组中三个标志性基因α-SMA、calponin、SM-MHC启动子区染色质开放性。对PCR产物运用凝胶分析软件对DNA的量进行定量分析。结果：随着时间的递增，分化后的BMSCs启动子区的PCR扩增效率明显低于未分化的BMSCs，说明与BMSCs接触共培养能显著的增强BMSCs平滑肌相关蛋白启动子区域对核酸酶的敏感性，使启动子开放性增强，开启上游抗性基因和下游报告基因的表达，增加外源基因的转化效率和转化频率。2. ChIP检测α-SMA、SM-MHC以及Calponin启动子区H4表观遗传修饰状态，Transwell上室面取培养组和对照组中BMSCs，用甲醛固定活细胞，超声将DNA打断成不同大小的片段，用目的蛋白质H4特异性抗体免疫沉淀该蛋白质-DNA复合物，复合物65℃解交联，分离纯化DNA，后进行定量PCR扩增，扩增条件为98℃30s，变性94℃20s，退火60℃1min，延伸60℃1min，共40个循环；Q-PCR检测BMSCs分化前后平滑肌标志性基因启动子区乙酰化差异。结果：经共培养诱导分化后，α-SMA、SM-MHC和Calponin启动子区乙酰化程度较未分化前显著增加，平滑肌标志基因启动子区DNA的乙酰化可能参与了BMSCs向SMCs分化过程。结论：本研究成功的分离出了骨髓间充质干细胞及膀胱平滑肌细胞，并成功建立了接触共培养体系并模拟体内环境建立了体外诱导分化模型，在该模型的基础上研究了组蛋白乙酰化对BMSCs分化水平的影响。研究表明，干细胞分化后目的基因启动子区域存在乙酰化程度高表达。