新生儿肠损伤是儿科常见的疾病之一，其发生的主要原因有早产、窒息引起的缺血缺氧以及感染等。其中严重感染常可导致危重患儿胃肠功能衰竭。肠道在全身炎症反应综合征（SIRS）和多器官功能障碍综合征(MODS)的发生发展过程中扮演着极其重要的角色。肠道感染或缺血缺氧会导致肠黏膜屏障功能受损，引起细菌及内毒素的移位，引发败血症和脓毒性休克，从而进一步加重肠组织的损伤，甚者可伴随远隔器官受累。脂多糖（LPS）作为典型的内毒素,可诱发内毒素血症，导致肠黏膜损害。国内外诸多研究发现缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）在内毒素性肠损伤的病理改变过程中具有重要作用。有研究指出肠道缺血缺氧可以诱导肠黏膜HIF-1α持续高表达，这一结果至少在部分程度上是由于肠道细菌的移位及其产物（如LPS）的增加所造成的。HIF-1α能够通过激活其下游的相关基因转录并促进炎症因子的大量释放和引起细胞凋亡等，从而加重内毒素血症或缺血/再灌注时的组织损伤。盐酸戊乙奎醚（PHC）是我国自主研制的抗胆碱药。研究表明，盐酸戊乙奎醚因能改善微循环、降低毛细血管壁通透性和减少溶酶体释放而具有多器官保护作用。目前盐酸戊乙奎醚对内毒素性肺损伤的保护作用得到了广泛地证实和认可，我们通过大量的临床观察发现盐酸戊乙奎醚在解除肠痉挛、减轻肠道水肿方面同样具有良好的效果。基于以上背景，本课题旨在研究内毒素致新生大鼠肠损伤时盐酸戊乙奎醚预先给药对肠组织HIF-1α表达的影响，并对其肠保护作用机制进行初步探讨。目的探讨盐酸戊乙奎醚预先给药对内毒素致新生大鼠肠损伤时肠组织HIF-1α和其他相关细胞因子表达的影响及其发挥肠保护作用的可能机制，为临床防治新生儿肠损伤提供一条新的思路。材料与方法1.研究对象69只SPF级健康新生7日龄SD大鼠，由郑州大学河南省实验动物中心提供，雌雄不限，体重18±2g。2.实验方法2.1实验动物分组本实验分为两部分。第一部分：将30只幼鼠随机分为3组，每组10只。分别为生理盐水对照组（C组）、内毒素致肠损伤模型组（L组）和盐酸戊乙奎醚干预组（P组）。本部分实验主要进行肠组织湿/干重比的测定、肠组织HE染色后光镜下形态学改变的观察以及相关细胞因子的检测。第二部分：同样将另39只健康新生7日龄SD大鼠随机分为C组、L组和P组，每组13只。本部分实验用于观察造模后各组幼鼠行为活动的改变并计算每组24h生存率。2.2动物模型的制备内毒素致肠损伤模型组腹腔注射内毒素（细菌脂多糖LPS，E.Coli055：B5，Sigma公司，美国）5mg/kg，配制浓度为0.5mg/ml；盐酸戊乙奎醚干预组在注射内毒素前30min，先腹腔注射盐酸戊乙奎醚（成都力思特制药股份有限公司，批号：120603）2mg/kg，配制浓度为0.05mg/ml；生理盐水对照组腹腔注射生理盐水10ml/kg。第一部分实验于腹腔注射内毒素或生理盐水后6h麻醉并解剖幼鼠。两部分实验均在造模完成后将幼鼠放回鼠笼与母鼠共同喂养。2.3肠组织的标本采集在密闭玻璃容器中吸入七氟烷快速麻醉幼鼠后，将其固定于操作台，解剖，用1ml注射器迅速进行心脏采血，静置2小时，4℃下4000r/min离心15分钟，取上清液，-20℃冰箱中保存待检。距回盲部3cm向上取回肠组织7cm，4℃生理盐水冲洗肠管3遍，滤纸吸干肠组织表面水分后，将7cm回肠组织分为4段：上段1cm用于光镜下形态学观察，中上段2cm用于测量肠组织湿重和干重，中下段2cm用于制备肠组织匀浆测定相关细胞因子的表达，下段2cm用于RT-PCR检测肠组织HIF-1α mRNA的表达。2.4检测指标2.4.1计算肠组织湿/干重比（W/D）电子称重计称量中上段2cm回肠组织并记录湿重，随后放入70℃恒温烘干箱烘干48h至重量不再发生变化，测量干重，计算湿/干重比。2.4.2肠组织形态学观察将上段1cm回肠组织放入4%多聚甲醛中保存待检。石蜡包埋后制作5μm病理切片，行HE染色。400倍光镜下观察回肠组织黏膜上皮细胞形态学的改变。2.4.3ELISA法测定肠组织中TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln、二胺氧化酶（DAO）及血清DAO的含量中下段2cm回肠组织称重后制备组织匀浆，4℃下3000r/min离心15分钟，取上清液，置于-20℃冰箱中保存待检。TNF-α、IL-6、HIF-1α、Gln和DAO的检测严格按照ELISA试剂盒（R&D公司，美国）说明书进行。2.4.4RT-PCR法测定肠组织HIF-1α mRNA的表达将下段2cm回肠组织经DEPC水冲净后滤纸吸干，经液氮迅速冷却后放入冻存管中，置于-80℃冰箱保存待检。经肠组织总RNA的提取、逆转录、DNA扩增和琼脂糖凝胶电泳等步骤检测幼鼠肠组织HIF-1α mRNA的表达情况。3．统计学处理采用SPSS17.0统计软件包进行统计学分析，计量资料以均数±标准差(x±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用最小显著差异法（LSD-t），以α=0.05为检验水准，即P<0.05时，组间差异有统计学意义。结果1.肉眼观察，腹腔注射LPS后，1小时内L组与P组幼鼠开始出现浑身抖动，呼吸急促。2~3小时左右出现周身发凉，精神萎靡，活动度下降，并且进食减少。6小时左右出现明显的倦怠乏力，几乎不活动也不进食，甚者口唇青紫。P组幼鼠症状相对较轻，C组幼鼠活动、进食等情况正常。C组、L组及P组的24h生存率分别为100%、69.2%和92.3%，幼鼠死亡主要发生在注射LPS后12~24小时期间。2.与C组比较，L组和P组肠组织湿/干重比均显著升高（P<0.05）；与L组比较，P组的这一比值显著降低（P<0.05）。差异均有统计学意义。3.HE染色光镜结果显示：C组回肠绒毛结构完整，上皮细胞排列整齐，形态正常；L组可见绒毛细胞水肿，上皮细胞排列紊乱；P组绒毛水肿较L组明显减轻，上皮细胞排列较整齐。4.与C组比较，L组和P组肠组织TNF-α、IL-6、HIF-1α的含量均升高（P<0.05），而Gln的含量降低（P<0.05）；与L组比较，P组肠组织Gln的含量较高（P<0.05），而余各指标的含量均较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。5.与C组比较，L组和P组肠组织DAO含量均显著降低，而血清DAO含量升高（P<0.05）；与L组比较，P组肠组织DAO含量较高，而血清DAO含量较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。6.与C组比较，L组和P组肠组织HIF-1α mRNA的表达量均升高（P<0.05）；与L组相比，P组肠组织HIF-1α mRNA的表达量较低（P<0.05）。差异均有统计学意义。结论盐酸戊乙奎醚预先给药能够减轻内毒素血症时的肠道水肿，减轻肠组织炎症反应，降低肠黏膜屏障的通透性。其肠保护作用机制可能与其下调HIF-1α的表达有关。