上世纪八十年代以来,由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)感染而引发的结核病(Tuberculosis,TB)在世界范围内再次重现流行趋势,严重危害公共健康。艾滋病与结核病之间的协同作用,以及多重耐药性结核分枝杆菌的不断增加,使得现有的抗结核治疗方案不能达到有效治愈的目的。抗结核新药的发现距今已超过四十年,现今迫切需要发现新的抗结核药物靶点,研制开发新型抗结核药物。　　 丝氨酸乙酰基转移酶CysE普遍存在于植物及微生物体中,但在哺乳类动物中没有发现。该酶参与催化生物体中半胱氨酸合成的第一步反应(如图1所示),即以L-丝氨酸(L-Serine)及乙酰辅酶A(AcCoA)为底物催化生成氧-乙酰丝氨酸(O-acetyl-L-Ser)和辅酶A(CoASH),第二步反应由氧-乙酰基-L-丝氨酸硫化氢解酶(O-acetyl-L-Ser sulfhydrylase)催化生成L-半胱氨酸(L-cysteine)。结核分支杆菌丝氨酸乙酰基转移酶CysE属于结核分枝杆菌正常生长所需酶类,其突变可影响菌株的正常生长,是一个潜在的新型抗结核药物靶点。　　 本论文目的是:(1)用PCR方法以结核分枝杆菌基因组DNA为模板扩增Tb cysE基因;(2)将Tb cysE基因克隆到pMD18-T克隆载体,并进行DNA序列测定;(3)将Tb cysE基因亚克隆到表达载体pET29b中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达CysE蛋白;(4)采用亲和层析方法纯化CysE蛋白,并用Western blotting方法进行鉴定:(5)建立测定CysE酶活性的方法;(6)确定CysE酶的最佳反应条件并进行相关反应动力学常数Km、Vmax的测定。　　 本论文所获的结果如下:　　 1.利用PCR方法扩增目的基因Tb cysE从结核分枝杆菌 H37Rv菌株的基因组数据库(网址为http://genolist.pasteur.fr/TubercuList)中获得基因Tb cysE核苷酸序列(690bp)。据该序列设计一对PCR引物,并在上下游引物的5’端分别引入NdeI和XhoI限制性内切酶位点(以便将Tb cysE基因克隆到pET29b表达载体的NdeI和XhoI位点)。以菌株H37Rv基因组DNA为模板,用LA TaqDNA聚合酶成功扩增出Tb cysE基因。　　 2.构建重组克隆载体pMD18-Tb eysE并进行核苷酸序列测定将已纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,并转入大肠杆菌NovaBlue菌株的感受态细胞中。用限制性内切酶酶切鉴定阳性重组质粒。对pMD18-Tb cysE中的Tb-cysE基因进行核苷酸序列测定,并进行Multalin.分析,结果表明所克隆的Tb-cysE基因与结核分枝杆菌H37Rv菌株基因组数据库中Tb cysE基因的核苷酸序列一致,即利用PCR技术扩增出的Tb cysE基因不存在碱基突变。　　 3.构建重组表达载体pET29b-Tb cysE用NdeI和XhoI双酶切质粒pMD18-Tb cysE,回收纯化目的片段Tb-cysE基因,将其连接到表达载体pET29b的NdeI和XhoI位点,构建pET29b-Tb cysE表达质粒。用EcoRI和XhoI双酶切方法鉴定阳性重组质粒,将要表达的重组CysE蛋白的C端与质粒上的组氨酸标签形成融合蛋白。　　 4.用大肠杆菌BL21(DE3)菌株表达Tb CysE蛋白并纯化将质粒pET29b-Tb cysE转化到BL21(DE3)感受态细胞中,用IPTG诱导表达Tb CysE蛋白。超声破碎BL21(DE3)诱导菌株细胞,对上清和沉淀组分进行SDS-PAGE和Western blotting分析,结果表明CysE蛋白在BL21(DE3)中可溶性表达。　　 采用组氨酸-镍柱亲和层析技术纯化CysE蛋白,对纯化蛋白进行蛋白质定量(考马斯亮蓝法),第1ml所纯化CysE蛋白的浓度为37ug/ml。SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明CysE蛋白的纯度较高。　　 5.CysE酶活性测定方法的建立　　 向酶反应体系中加入DTNB(Ellman’s Reagent),用酶标仪在405nm处测定光吸收值的变化,进而得出反应产物HSCoA生成量。　　 6.CysE酶的相关反应动力学研究　　 (1)初速度的确定:　　 将反应底物L-Ser、AcCoA与不同浓度CysE蛋白在37℃反应不同时间,绘制酶浓度曲线及反应时间进程曲线。结果表明CysE丝氨酸乙酰基转移酶反应初速度酶浓度范围为0.74ug/ml,时间范围为5min。　　 (2)CysE酶促反应的最佳反应条件的确定　　 分别改变反应的温度和反应体系的pH值,测定产物HSCoA生成量。CysE丝氨酸乙酰基转移酶催化的最适温度为37℃,最适pH值为7.5,该酶活性不需要Mg2+的参与。　　 (3)最佳反应条件下CysE酶促反应动力学常数的测定　　 在最佳反应条件及酶促反应初速度范围,保证一种底物过量,同时改变另一底物的浓度进行反应。采用双倒数法分别测定两底物的Km、Vmax值。底物AcCoA的Km值为0.051335±0.00499mM,最大速率Vmax值为0.008189+0.00047mM-1min;L-Ser的Km值为0.026405±0.00063mM,Vmax值为0.006455±0.00047mM-1min。　　 结论:　　 在本研究中,构建了pET29b-Tb cysE重组表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达出可溶性蛋白CysE。建立了CysE酶活性鉴定方法并已进行相关酶促反应动力学研究,确定了最佳反应条件及反应动力学常数Km及Vmax。