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研究背景及目的结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是人体消化系统常见恶性肿瘤之一,其发生及发展存在长期的癌前状态,这为结直肠癌的预防提供了契机。杂环胺类化合物(Heterocyclic amines,HAs)作为一种结直肠癌食源性致癌物,该物质在人体中的分解以及代谢主要通过尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶(UDP glucuronosyltransferase 1A,UGT1A)所介导的葡萄糖醛酸结合反应。莱菔硫烷(sulforaphane,SFN)是一种异硫氰酸酯类的植物化学物质,具有抗氧化、抗炎、预防癌症、抗癌等作用。既往研究表明SFN能够上调UGT1A的表达,从而增加杂环胺类化合物的分解代谢。但其中SFN如何上调UGT1A的具体的作用机制尚不明确。本研究旨在前期研究的基础上深入研究SFN诱导UGT1A上调的作用机制,为CRC的基础研究和化学预防提供新的认识。研究方法1.本研究通过MTT实验、细胞集落形成实验及EdU实验,检测了 SFN处理后的CRC细胞(HT-29和SW480)活力和增殖能力。划痕实验及Transwell迁移实验用于检测CRC细胞在不同SFN浓度环境中的迁移能力。2.使用流式细胞术检测了不同浓度SFN作用于CRC细胞后,分析其细胞周期及细胞凋亡变化。3.不同浓度SFN分别处理细胞,通过实时定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)及蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测其 p-ERK、ERK、Nrf2及UGT1A的分子表达,通过细胞免疫荧光技术观察Nrf2的表达及定位。4.设计核因子E2 相关因子 2(Nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)短发夹 RNA(shRNA)和阴性对照(Negativecontrol,NC)shRNA,转染于 CRC 细胞中,通过RNA干扰技术得到Nrf2 shRNA及NC shRNA稳转细胞系。分别用含或不含SFN的培养基处理细胞,分为6组:NC shRNA组,NC shRNA+10μmol/LSFN组,NC shRNA+20μmol/LSFN 组,Nrf2 shRNA 组,Nrf2shRNA+10μmol/L 组和Nrf2 shRNA+20μmol/L SFN 组,实时定量 PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)和Western blotting用于验证Nrf2在SFN诱导UGT1A中的作用。5.将细胞分为Control组、SFN及PD98059+SFN组。通过Western blotting实验技术检测各组细胞的Nrf2和UGT1A蛋白水平。通过活性氧检测试剂盒检测各组CRC 细胞中的活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平。6.裸鼠皮下成瘤实验,给予不同浓度SFN,观察瘤体体积及质量变化。研究结果1.SFN抑制HT-29细胞及SW480细胞的增殖活性、细胞集落形成能力及细胞迁移能力,且具有浓度依赖性及时间依赖性(P<0.05)。2.SFN处理HT-29和SW480细胞后,其细胞周期阻滞于G0/G1期,同时SFN的处理促进了细胞凋亡。(P<0.05)。3.SFN激活了 ERK通路,诱导Nrf2核内转位,上调UGT1A的表达(P<0.05)。4.SFN上调了 NC组的UGT1A的表达,但在Nrf2 shRNA组中SFN的上调作用明显减弱(P<0.05)。5.用PD58059预处理的组别中,SFN诱导Nrf2核内转位能力及诱导UGT1A表达能力受到抑制,且诱导产生ROS的能力下降(P<0.05)。6.SFN抑制CRC细胞在裸鼠皮下成瘤,且具有浓度依赖性(P<0.05)。结论1.SFN浓度依赖性抑制CRC细胞增殖活力、抑制细胞周期、促进凋亡、降低CRC细胞的迁移能力。2.SFN通过Nrf2转录因子诱导了 UGT1A的表达。3.SFN可能通过激活ERK通路促进Nrf2核内转位,诱导UGT1A的表达。