盐胁迫下棉花细胞壁重塑相关基因GhEXLB1与GhGRP1功能研究

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细胞壁是植物细胞动态的、复杂的结构,是细胞与环境相互作用的中介。在非生物胁迫下,细胞壁结构被重塑以适应新的环境条件,这对于植物的发育及对环境胁迫的适应尤为重要。本研究以耐盐品系中9807为材料,对其盐胁迫下细胞形态和代谢物变化进行了分析;通过对其盐胁迫下的转录组分析,挖掘了2个调控细胞壁重塑的蛋白基因:富含甘氨酸的细胞壁组成蛋白基因GhGRP1和扩展蛋白基因GhEXLB1;借助扫描电镜和透射电镜我们对基因沉默棉株的维管区细胞壁变化进行了观察,对GhGRP1和GhEXLB1基因在转基因拟南芥和棉花中的表达调控,以及转基因棉花细胞壁果胶含量进行了分析,主要研究结果如下:1.耐盐材料通过维管组织形态和结构的改变来应对高盐胁迫通过对中9807盐胁迫下膜透性和膜脂过氧化研究,我们发现中9807相比于盐敏感材料对高盐胁迫具有较高的适应性。借助切片手段对中9807维管区盐胁迫下形态观察,发现耐盐材料通过改变木质部、韧皮部和形成层的形态结构来响应外部高盐胁迫;通过对盐胁迫前后叶片重量变化的分析,我们认为棉株响应盐胁迫存在一个与保水功能有关的应激反应,表现为维管束面积和导管面积在短时间内应激收缩,随着盐胁迫时间推移,棉株在适应这种胁迫后维管束面积和导管面积有一个恢复的过程。在这个过程中我们发现D-半乳糖、D-半乳糖醛酸、鼠李糖的含量也随之升高,显示了果胶含量的上升,表明在这个过程中果胶可能参与了调控。而芥子醇、香豆醇和松柏醇含量上升说明木质素沉积增加,表明高盐胁迫下棉花维管区细胞壁强度的增加。2.维管组织通过细胞壁的重塑功能实现形态改变对基因沉默棉株维管组织细胞壁进行扫描电镜和透射电镜分析发现:GhEXLB1基因沉默棉株在受到盐胁迫后,细胞壁延展受抑制,形态上表现为细胞膨大停滞,但对细胞壁增厚影响较小,这造成了三个细胞相连接的胞间层趋于闭合状态。而GhGRP1基因沉默棉株在受到盐胁迫时,其维管区韧皮部和木质部的细胞壁增厚均受到了抑制,在形态上木质部导管和韧皮部被挤压变形,特别是木质部细胞出现了较为频繁的次生壁坍塌现象,说明GhGRP1基因对初生壁的强度,以及对次生壁的生长和支撑都具有重要作用。通过对基因沉默棉株细胞壁多糖基因的表达发现,GhGRP1基因的沉默使更多的细胞壁多糖代谢相关基因表达下调,一些参与细胞壁组成的基因如纤维素合酶催化亚基CESA3等都显著下调,GhGRP1基因的沉默导致细胞壁骨架结构支撑作用受到影响,是细胞壁变脆弱的原因。而GhEXLB1基因的沉默,使多糖网络打开受限,如木质素降解基因LAC14、木聚糖内糖基水解酶基因XTH6表达下降,GhEXLB1基因更多的是通过改变多糖间的共价连接来影响细胞壁的重塑。3.GhEXLB1基因高表达对GhGRP1基因表达存在抑制作用我们在拟南芥超表达和棉花超表达实验的研究结果显示:在正常生长的转GhEXLB1基因拟南芥中,拟南芥内源基因At GRP1相比野生型显著受到抑制,在盐诱导后,两个基因表达均上升,GhEXLB1基因对GhGRP1基因的抑制作用随之消失。在转基因棉花中,我们的实验结果与拟南芥中一致。GhGRP1基因与GhEXLB1基因在功能上具有相反的作用,他们是通过相反的方式对细胞壁重塑产生影响,双分子荧光互补实验结果显示这两个基因表达的蛋白存在互作关系。4.果胶调控GhEXLB1与GhGRP1基因间表达平衡从而影响细胞壁重塑转录组和代谢组数据分析表明,一些与细胞壁相关的多聚糖代谢物响应了棉花高盐胁迫,例如果胶骨架同半乳糖醛酸(HG),其含量的增加表明盐胁迫后果胶含量的增加。果胶含量和甲酯化程度在最近的研究中被证明对细胞壁结构重塑十分重要。与代谢组数据和转录组数据相反,半乳糖醛酸转移酶基因GAUT1在基因沉默棉株中均显著下降,说明GhGRP1和GhEXLB1基因的表达和果胶紧密相关;而果胶酯酶基因PEM6的表达与GhGRP1呈负相关,与GhEXLB1基因正相关,说明GhEXLB1基因对GhGRP1基因的表达抑制受到果胶酯化程度调控。转基因棉株维管组织细胞壁免疫组化结果进一步证明了果胶通过调控GhEXLB1基因和GhGRP1基因间的表达平衡实现对胞壁重塑影响。
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