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目的口腔鳞状细胞癌是口腔颌面部常见的恶性肿瘤之一,罹患口腔鳞状细胞癌的患者的言语、进食及面部美观等均会受到严重的影响。近年来口腔鳞状细胞癌的发病率和死亡率并没有得到显著的改善,同时导致口腔鳞状细胞癌进展的病因目前尚未明确。NOTCH信号通路自发现至今,已经有许多的研究报道指出它的异常表达和突变会对肿瘤的发生发展产生影响。本研究根据TCGA数据库数据发现NOTCH1在头颈部鳞癌中突变率高达18%。NOTCH信号通路的异常表达对口腔鳞状细胞癌的进展究竟有怎样的影响?NOTCH信号通路的异常表达是否与NOTCH信号通路的突变有关?NOTCH信号通路的突变是否能够影响口腔鳞状细胞癌的进展?以上这些问题目前均未明确。因此,本课题研究的目的是探索NOTCH信号通路表达下调后,对口腔鳞状细胞癌进展的影响,分析人群中口腔鳞状细胞癌的突变频率和分布的情况,进一步研究NOTCH信号通路突变体对口腔鳞状细胞癌细胞功能的影响,为临床寻找口腔鳞状细胞癌的治疗靶点提供实验研究基础。方法1.NOTCH信号通路异常表达对口腔鳞状细胞癌发生发展的影响一方面,采用si RNA干扰法分别抑制NOTCH1和NOTCH2在口腔鳞状细胞癌细胞株中的表达,接着运用Real-time PCR和Western blot技术分别检测NOTCH1、NOTCH2基因在口腔鳞状细胞癌细胞中表达情况;运用CCK-8实验和平板克隆形成实验分别检测口腔鳞状细胞癌细胞增殖情况的改变;利用Annexin V-PI双染法检测细胞凋亡的改变,PI单染法检测细胞周期的改变;利用划痕愈合实验及Transwell小室实验观察细胞迁移和侵袭能力的变化;最后利用干细胞成球培养,检测肿瘤细胞自我更新能力的改变。另一方面,运用NOTCH信号通路抑制剂:FLI-06、RO-4929097分别处理293T细胞,检测两种抑制剂对NOTCH信号通路活化的影响。接着运用半对数浓度稀释法,将它们分别作用于四种口腔鳞状细胞癌细胞株CAL-27,TCA-8113,SCC-9和WSU-HN30,处理72小时后利用CCK-8法检测450nm处的吸光光度值,并计算IC50。最后,将两种NOTCH信号通路抑制剂运用于口腔鳞状细胞癌肿瘤干细胞球体,分别观察NOTCH信号通路抑制剂对口腔鳞状细胞癌细胞自我更新能力的影响,以及对已形成肿瘤干细胞球体的渗透破坏能力;运用Real-time PCR检测NOTCH信号通路抑制剂对肿瘤干细胞相关基因表达的影响。2.NOTCH信号通路突变与口腔鳞状细胞癌的关联研究首先,收集15对口腔鳞状细胞癌组织及癌旁组织标本,提取DNA后进行全外显子测序,并进行生物信息学分析,了解NOTCH信号通路在口腔鳞状细胞癌中的突变分布情况,从中筛选出NOTCH信号通路突变位点。其次,通过COSMIC数据库筛选出NOTCH1在头颈部鳞癌或所有肿瘤中的高频突变位点。最后,利用Sanger测序在更数量的口腔鳞状细胞癌组织、癌旁组织、病人血液及健康人血液的DNA样本中检测NOTCH基因的点突变的分布情况。收集患者临床资料,包括性别、年龄、术前放化疗、淋巴结转移和肿瘤的临床分期等,分析其与NOTCH突变的关联性。利用Real-time PCR检测突变的口腔鳞状细胞癌组织和未突变的口腔鳞状细胞癌组织中NOTCH1的表达情况。3.NOTCH1定点突变对口腔鳞状细胞癌细胞功能的影响利用基因定点突变试剂盒构建NOTCH1定点突变质粒,构建后的质粒经Sanger测序检测是否构建成功。将空白对照、野生型和突变型质粒分别转染293T细胞、人食管鳞癌KYSE-150细胞和口腔鳞状细胞癌SCC-9细胞后,利用Western blot检测NOTCH1表达情况的改变;细胞增殖能力的变化运用CCK-8实验和平板克隆实验进行检测;划痕愈合实验检测细胞迁移能力的变化;利用双荧光素酶报告实验检测NOTCH1的点突变对NOTCH信号通路活化的影响;Realtime PCR检测NOTCH1点突变后对NOTCH信号通路下游基因表达的影响。结果1.NOTCH信号通路异常表达对口腔鳞状细胞癌发生发展的影响NOTCH1的表达下调后口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均随之下调、细胞凋亡增多、细胞周期受阻滞于G2期,口腔鳞状细胞癌肿瘤细胞自我更新能力同样受抑制。当NOTCH2表达下调后,口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力同样受到抑制、细胞凋亡增多。运用NOTCH信号通路抑制剂处理口腔鳞状细胞癌细胞株,FLI-06在口腔鳞状细胞癌细胞株中的IC50值分别为:CAL-27为3.8-7.8μM;TCA-8113为3.1-3.8μM;WSU-HN30为5.0-7.7μM;SCC-9为0.6-4.3μM,而RO-4929097直接作用于口腔鳞状细胞癌细胞株后对细胞的增殖没有抑制作用。但是,将FLI-06和RO-4929097分别作用于口腔鳞状细胞癌肿瘤干细胞后,发现两种抑制剂在较低浓度时均能抑制口腔鳞状细胞癌细胞的自我更新能力,FLI-06还可渗透肿瘤干细胞球破坏肿瘤干细胞球体的完整性,但RO-4929097对肿瘤干细胞球渗透破坏能力较差。2.NOTCH信号通路突变与口腔鳞状细胞癌的关联研究外显子测序结果显示:在15对口腔鳞状细胞癌样本中分别检测到1个NOTCH1错义突变位点NOTCH1-G484D;1个NOTCH2错义突变位点NOTCH2-N2265K;1个NOTCH3错义突变位点NOTCH3-T1751A。从COSMIC肿瘤突变数据库中选择了NOTCH1-T194P,NOTCH1-T311P,NOTCH1-D573A,NOTCH1-L1600P及NOTCH1-L1678P这5个位点。在更大样本量的口腔鳞状细胞癌组织和癌旁组织标本中对以上8个突变位点进行Sanger测序分析。结果显示:在口腔鳞状细胞癌中NOTCH1-484位点存在G>D,G>R,G>C,G>S,G>A这5种类型的错义突变,将它们的突变例数进行合并计算,得出该位点在口腔鳞状细胞癌中的突变率为11.0%,癌旁组织中的突变率为2.3%,但在口腔鳞状细胞癌患者血液样品和健康人血液样品中均未检测到突变。NOTCH1-L1678P位点在口腔鳞状细胞癌组织中的突变率为17%,在癌旁组织中的突变率为1.2%,病人血液样本中未检测到突变,健康人血液样品中突变率为2.8%。在口腔鳞状细胞癌样本中未发现NOTCH1-T194P,NOTCH1-T311P、NOTCH1-D573A、NOTCH1-L1600P、NOTCH2-N2265K及NOTCH3-T1751A位点存在突变。在接受过术前放疗的患者中NOTCH1-484位点的突变率升高。NOTCH1的m RNA的表达水平在突变的口腔鳞状细胞癌组织中较野生型的口腔鳞状细胞癌组织中稍有升高,但差异没有统计学意义（P>0.05）。3.NOTCH1定点突变对口腔鳞状细胞癌细胞功能的影响成功构建NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S和NOTCH1-L1678P点突变质粒。Western blot检测野生型和突变型质粒在293T细胞、KYSE-150细胞和SCC-9细胞中均有表达。野生型的NOTCH1过表达能够促进293T,KYSE-150和SCC-9细胞的增殖,但是突变型和野生型的NOTCH1对293T、KYSE-150和SCC-9细胞的生长能力的影响没有明显的差异（P>0.05）。野生型和突变型的NOTCH1对KYSE-150细胞的迁移能力的影响无明显差异（P>0.05）。双荧光素酶报告实验发现NOTCH1-L1678P突变后NOTCH信号通路被活化,而NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S发生突变后NOTCH信号通路失活。Real-time PCR显示NOTCH1-L1678P突变后,NOTCH信号通路下游基因HES5表达升高。结论NOTCH1和NOTCH2在口腔鳞状细胞癌中起着促癌基因的作用。在口腔鳞状细胞癌组织中检测到NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S和NOTCH1-L1678P突变率较高,可能会对口腔鳞状细胞癌的发生发展产生影响。其中,NOTCH1-L1678P为激活性突变,可通过NOTCH-HES5途径激活NOTCH信号通路,而NOTCH1-G484A,NOTCH1-G484C,NOTCH1-G484D,NOTCH1-G484R,NOTCH1-G484S位点的突变对NOTCH信号通路活化没有影响。NOTCH信号通路的突变与口腔鳞状细胞癌的发生发展密切相关,NOTCH的突变可影响信号通路的活化,其中具体的机制有待于深入的探讨。