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目的:放射治疗作为治疗恶性肿瘤的三大手段之一,已广泛应用于结直肠癌的新辅助治疗,但仍有约30%患者放疗无效。放疗可增加肿瘤免疫原性,但放疗后肿瘤区域大量肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages,TAM）的浸润及组织中PD-L1表达上调可能限制了其疗效。放疗联合抗肿瘤免疫治疗在结直肠癌中是否可获得协同效应及机制如何,目前尚不明晰。本课题主要研究目的如下:（1）评价巨噬细胞相关生物标志物（CD163、CD68、CSF-1和CCL2）在预测新辅助放化疗（Neoadjuvant chemoradiotherapy,NCRT）反应和局部进展期直肠癌（Locally advanced rectal cancer,LARC）预后方面的价值;（2）研究结直肠癌细胞在放疗后细胞因子分泌的变化及在肿瘤微环境中对TAM极化和PD-L1表达的影响;（3）探索肿瘤微环境中CSF-1介导的TAM极化对T淋巴细胞成熟、分化,及发挥抗肿瘤细胞毒作用的影响;（4）探讨抑制CSF-1联合放疗以及抗PD-L1治疗的作用机制,并观察联合治疗效果,为开展结直肠癌治疗新方案的临床试验和研究提供理论依据。方法:1.收集福建医科大学附属协和医院结直肠外科2011-2015年期间191例接受新辅助放化疗（NCRT）和根治性切除术的患者。收集术前结肠镜活检及术后肿瘤组织,并行免疫组化分析。2.采用CT26、MC38两种小鼠结直肠癌细胞,予不同剂量放疗,利用ELISA及流式细胞技术,在不同时间点分析放疗对其细胞因子分泌及肿瘤细胞PD-L1表达的影响。3.体外分离培养小鼠骨髓源性巨噬细胞（BMDM）,并与不同剂量放疗后的MC38细胞体外共培养,通过流式细胞术分析BMDM表面CD11b、F4/80、CD206表达情况研究其极化表型。体外分离培养小鼠脾淋巴细胞,与放疗后的MC38细胞及不同极化表型的BMDM共培养,通过流式细胞术分析淋巴细CD4、CD8、CD25、CD127、TNF-α表达,研究其对T淋巴细胞分化及功能的影响;使用CSF-1R抑制剂PLX3397,研究阻断CSF-1介导的TAM极化,对T淋巴细胞分化及功能的影响。4.构建小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型,对肿瘤局部行3×4Gy放疗,第6天收集小鼠外周血、脾组织、肿瘤组织,通过流式细胞术分析不同组织中免疫细胞PD-L1、巨噬细胞CD206、T淋巴细胞CD4、CD8、CD25、CD127、TNF-α表达情况,通过RT-q PCR技术分析i NOS、IRF5、Arg1、IL-10、PD-L1等m RNA转录水平,研究放疗对肿瘤微环境中PD-L1表达、TAM极化及T淋巴细胞分化及功能的影响,探讨放疗所导致的肿瘤免疫微环境的抑制机制。5.构建小鼠荷瘤模型,随机分为5组:对照组（Ctrl组）、放疗组（RT组）、放疗+抗PD-L1组（RP组）、放疗+抗CSF-1组（RM组）、放疗+抗PD-L1+抗CSF-1R组（RPM组）,予不同方案治疗。第6天收集小鼠外周血、脾组织、肿瘤组织,行流式细胞术检测,收集肿瘤组织通过RT-q PCR技术,固定包埋肿瘤组织,行免疫组化抗体CD68、CD206、i NOS、CSF-1、PD-L1染色,分析不同治疗方案对小鼠肿瘤微环境的影响。6.构建小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型,随机分5组治疗。绘制瘤体生长曲线分析,比较各治疗方案的近期抗肿瘤效果。同法分组治疗,观察测量小鼠肿瘤生长情况直至观察终点,绘制小鼠生存曲线,分析比较各治疗方案的远期抗肿瘤效果。结果:1.术后肿瘤组织中病理完全反应（p CR）组巨噬细胞相关标志物CD163、CD68、CSF-1、CCL2的表达水平较非p CR组低。NCRT前及术后较低的CD163、CD68、CSF-1、CCL2评分与DFS改善相关。Cox回归分析显示NCRT前CD163评分（HR=1.008,95%CI 1.003-1.013,P=0.003）和CSF-1评分（HR=2.187,95%CI1.343-3.564,P=0.002）是DFS的独立预测因素。2.基于Cox多因素分析,我们构建了一个具有较强预测LARC患者p CR能力的风险评分模型。并通过COX回归分析探讨风险评分在LARC患者中的作用。结果显示,肿瘤大小（HR=1.291,P=0.041）、较差的病理TNM分期（HR=1.789,P=0.005）和较高的风险评分（HR=1.084,P=0.001）与无病生存较差显著相关。基于以上结果,生成列线图和决策曲线分析。3.体外实验显示,放疗引起小鼠结直肠癌细胞CT26、MC38 PD-L1表达上调及分泌CCL2、CSF-1增加。4.共培养结果显示,放疗后的MC38细胞诱导了BMDM向M2型极化。与对照组相比,在与接受放疗后的MC38细胞共培养48h后,BMDM表现出明显增加了CD11b+/F4/80+CD206high的细胞的比例,且高表达PD-L1。CSF-1R抑制剂PLX3397,在体外抑制了M2型极化,揭示了CSF-1的介导作用。5.在与脾淋巴细胞共培养的实验中发现,放疗后的MC38细胞诱导向M2型极化的BMDM,抑制了CD8+T细胞活化和分泌TNF-α的功能。PLX3397可消除因此所导致的CD8+T细胞的功能抑制,重新激活了其抗肿瘤的作用。6.小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型显示,放疗诱导了小鼠外周血、脾组织、肿瘤组织中巨噬细胞PD-L1表达上调或高表达,放疗后小鼠肿瘤组织中巨噬细胞明显向M2型极化。放疗后小鼠外周血、脾组织中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞占比及CD4+/CD8+比值与对照组相比均无明显变化,但放疗后肿瘤组织中浸润的CD8+T淋巴细胞相对减少,升高了CD4+/CD8+比值。同时发现,放疗后肿瘤组织中具有抗肿瘤免疫抑制作用的CD4+Treg细胞比例增多了。7.放疗联合抗PD-L1治疗并未明显增加小鼠MC38结直肠癌组织中CD8+T细胞的浸润,但放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗逆转了小鼠结直肠癌肿瘤微环境TAM M2型极化,降低了肿瘤组织中PD-L1的表达,减少了CD4+Treg细胞的分化,增加了肿瘤微环境中的CD8+T细胞的比例并活化分泌TNF-α。8.在小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤模型中证实,放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗明显抑制了肿瘤的生长,延长了小鼠的生存,获得了良好的近期和远期疗效。结论:1.巨噬细胞相关生物标志物CD163、CD68、CSF-1和CCL2的表达水平与NCRT后LARC患者的放化疗耐药性和预后相关。建立了一个风险评分模型,用于预测LARC结果。2.放疗促进小鼠结直肠癌细胞PD-L1表达上调及CCL2、CSF-1的分泌增加。放疗诱导了CSF-1介导的巨噬细胞向M2型极化,且大量表达PD-L1,抑制了CD8+T细胞功能。3.放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗可逆转小鼠结直肠癌肿瘤微环境中TAM M2型极化,降低了肿瘤组织中PD-L1的表达,激活了CD8+T细胞功能,重塑了肿瘤免疫微环境。4.放疗联合抗CSF-1R及抗PD-L1的三联治疗明显抑制小鼠结直肠癌MC38细胞皮下移植瘤的生长,延长了小鼠生存,获得了良好的近、远期疗效。