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为了提高抗癌药物在体内的抑瘤效果,增加药物的靶向递送效率,达到更好的抗肿瘤作用。本课题设计了中药单体蟾毒灵（具有优异抗肿瘤作用）和尼达尼布（新型多靶点酪氨酸激酶抑制剂）联合给药策略。为了改善药物溶解度较低及副作用较大的问题,提高药物靶向递送效果,以多级修饰白蛋白（兼具靶向性和协同抑瘤作用）为材料通过同轴静电喷雾技术构建了新型给药系统。我们期待通过这种复方给药策略及新型的制剂技术的应用,能够更有效的发挥药物抗肿瘤效果,减少毒副作用,为抗肿瘤治疗提供指导和借鉴意义。具体内容如下。一、综述本部分首先对中药单体蟾毒灵（Bufalin,BF）和尼达尼布（Nintedanib,NDNB）在抗肿瘤方面的研究进展,及联合给药策略进行介绍;其次对白蛋白载体在药物传递系统中的应用进行简单叙述,阐述双胍基基团和熊去氧胆酸基团（Ursodeoxycholic Acid,UA）在抗肿瘤方面的特性,最后对新型的微纳米粒子制备技术-同轴静电喷雾技术的特点与应用进行介绍。二、处方前研究本部分建立了高效液相色谱法（HPLC）测定BF和NDNB药物浓度,两种药物检测专属性良好,在1-25μg/mL的浓度下检测符合线性要求。BF的定量限和检测限分别为75ng/mL和25 ng/mL;NDNB的定量限和检测限分别为110 ng/mL和40 ng/mL。其它方法学项下检查项目均符合要求。BF在pH7.4 PBS和pH7.4 PBS（0.1%吐温80）溶液中平衡溶解度分别为42.03±1.34μg/mL和876.77±2.71μg/mL,NDNB在pH7.4 PBS和pH7.4 PBS（0.1%吐温80）溶液中平衡溶解度分别为4.89±0.88μg/mL和95.03±1.06μg/mL。药物在不同浓度（1,10和25μg/mL）和几种介质（乙醇、pH7.4 PBS、pH7.4 PBS（0.1%吐温80）和pH7.4 PBS（0.1%吐温80,0.5%血清））中分析时间内稳定性符合要求。三、双胍基-熊去氧胆酸基团双修饰牛血清白蛋白的制备及其性质考察本部分首先合成了对双胍基苯甲酸（Para-biguanidinyl benzoyl acid,DP）,并对其结果进行表征。后通过碳二亚胺法使用UA和DP对牛血清白蛋白（Bovine albumin,BSA）进行修饰,制备各修饰蛋白UA-BSA、DP-BSA和DP-UA-BSA,通过荧光光谱和紫外光谱对小分子DP和UA对BSA相互作用做定性考察,表明了小分子对白蛋白的成功修饰。采用荧光胺法和质谱法测定UA-BSA中UA修饰度分别为10.68和8.56,两者结果基本一致;另外通过质谱法测定DP-BSA和DP-UA-BSA中DP的修饰度分别为38.15和29.15,进一步证明修饰蛋白的成功制备。最后通过MTT法对修饰蛋白进行安全性评价,各修饰蛋白在50-500μg/mL浓度范围内生物相容性良好。四、同轴静电喷雾技术制备载药白蛋白微粒及其体外性质考察本部分首先采用单轴静电喷雾技术成功制备白蛋白微球,粒径大小均一,在300nm-900 nm之间。后采用同轴静电喷雾技术制备载药白蛋白微粒,经单因素考察和中心复合设计优化处方工艺制备载药白蛋白微粒。表征结果表明:粒径分布均一,大小为879±56nm,电位为-5.86±1.12 mV。BF和NDNB的包封率分别为78.0%和76.2%,载药量分别为1.57%和2.20%。SEM、TEM和LSCM表征表明:载药白蛋白微粒中微球形态和核壳结构良好。经XRD图谱结果表明微粒中BF和NDNB无定型存在。体外释放结果表明,BF和NDNB在载药白蛋白微粒中的释放速率相比原料药明显减缓,且加入血清前后制剂组中药物溶出释放行为基本一致,稳定性良好。五、复方多修饰白蛋白微粒体外抑瘤效果、靶向效果及作用机制探讨本部分通过MTT法考察发现,各种微粒对肿瘤细胞（HepG2细胞）抑制效果比较如下:复方多修饰白蛋白微粒>复方单修饰白蛋白微粒>复方未修饰白蛋白微粒>单药物多修饰白蛋白微粒>原料药。经计算得给药系统中BF和NDNB的组合指数CI小于1,表明BF和NDNB对HepG2细胞抑制发挥协同作用。各修饰蛋白载药微粒中药物IC50变化趋势表明双修饰蛋白材料制备的微粒对HepG2细胞抑制具有双重促进作用。通过细胞摄取实验表明UA能促进HepG2细胞对白蛋白微粒的摄取效率。六、体内药物动力学、组织分布学与药效学研究本部分首先建立了BF和NDNB的体内分析方法,并对该方法的方法学进行考察,结果表明均符合测定要求。体内药动学结果表明,复方多修饰白蛋白微粒（BF-NDNB-DP-UA-BSA NPs）中BF的消除半衰期从0.526 h增加到2.948 h,药物在体内的平均滞留时间（MRT）也从1.224 h变为4.154 h;NDNB消除半衰期从1.733 h增加到4.130 h,药物在体内的平均滞留时间（MRT）也从2.064 h变为4.384 h。表明BF-NDNB-DP-UA-BSA NPs具有明显的缓释效果。通过活体成像技术对复方多修饰白蛋白微粒的靶向性进行评价,并通过离体组织考察微粒在小鼠体内的分布。由活体成像和离体组织分布结果可以看出,复方多修饰白蛋白微粒组经尾静脉注射吸收后与未修饰制剂组相比,在肿瘤部位摄取显著提高,具有良好的主动靶向效果。药效学评价结果表明制备的BF-NDNB-DP-UA-BSA NPs具有最强的抗肿瘤作用,BF和NDNB两种药物联合使用可提高制剂的抗肿瘤效果,且多修饰载体可通过DP自身抑瘤作用和UA主动靶向作用发挥双重抗肿瘤作用,增强抗肿瘤效果。表明BF-NDNB-DP-UA-BSA NPs能减少原料药的心脏毒性,对各器官无明显毒性,安全性良好。