一种鲜味八肽的呈味分析及克隆表达

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鲜味作为五种基本味觉之一,可以给人带来愉悦感,是人类必不可少的味觉需求之一。鲜味肽作为近年来发展的一类潜在食品肽类鲜味剂,能赋予食品特有的鲜味,还具有安全、营养、健康等特点,展现出极大的市场化潜力。但目前关于鲜味肽的研究多数都集中在食源性鲜味肽的提取和鉴定方面,缺乏鲜味肽结构特征、呈味原理等方面的研究。此外,尽管鲜味肽的生物制备相较于酶解提取法、化学合成法具有诸多优势,如低成本、高产量等,但关于鲜味肽的生产方法研究还处于起步阶段,并且都是集中在热点鲜味肽,因此,对于新鉴定的鲜味肽的生物制备还需进一步探索。本文以一种来源于罗非鱼的鲜味八肽(OSP)为研究对象,首先借助分子模拟研究了OSP与人源鲜味受体相互作用模式,探索鲜味八肽的结构特征,解析其呈味机理;然后采用多拷贝串联策略于工程菌中表达OSP,并优化了其工艺条件。主要研究内容如下:(1)采用结构建模、半柔性分子对接筛选和分子动力学模拟优化获得获得稳定的鲜味八肽与鲜味受体的对接复合物模型。通过相互作用分析发现,OSP与鲜味受体形成了较强的相互作用,包括氢键、盐键和π-离子键,并且氢键在这些相互作用力中占主导作用。进一步地,OSP序列中的疏水性基团对其形成特殊的高级构象有重要贡献,而其N端碱性基团和C端酸性基团是与鲜味受体相互作用的主要位点。(2)通过分子模拟分析发现,从能量和结构的角度,8OSP与鲜味受体的相互作用较强,表明8OSP是最具呈鲜潜力的串联鲜味八肽,因此确定具有最佳呈鲜潜力的串联拷贝为8OSP。随后通过密码子优化、双酶切连接、感受态转化等分子技术构建8OSP表达重组菌E.coli BL21/pMA09srfA-8OSP。最后采用感官评价验证重组菌表达的8OSP的呈味特性,结果显示8OSP具有略高于标准溶液的呈鲜强度,几乎不存在苦味、酸味等不良呈味,与鲜味八肽串联设计中的计算结果相一致,具有进一步开发成鲜味调味产品的潜力。(3)最后考察了摇瓶水平上培养基组成(碳源、氮源)和不同培养条件(接种量、培养温度、培养pH)对重组菌E.coli BL21/pMA09srfA-8OSP发酵生产串联鲜味八肽的影响,通过条件优化,获得了最适培养条件:碳源为葡萄糖、氮源为酵母膏+蛋白胨+(NH42SO4、接种量为1%、培养温度为37℃、pH为7.0,在该条件下摇瓶发酵生产8OSP的表达量为0.152 mg/mL,实现了8OSP的高效克隆表达。最后进行8OSP的分批发酵,8OSP浓度最终达到1.31 mg/mL,相较于摇瓶培养提高了8.6倍。上述工艺条件优化及分批发酵结果为大批量生产鲜味肽提供一定参考。
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