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背景:肾脏缺血再灌注损伤(ischemia reperfusion injury,IRI)是急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)最经典病因之一,肾小管坏死也是AKI最典型的病理改变。炎症反应被认为在AKI中扮演重要作用。文献报道在肾组织中单核/巨噬细胞的浸润以及炎症因子表达增高可能与IRI导致的AKI相关。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)家族中的P38MAPK是参与炎症反应最重要的成员,它在缺血再灌注损伤中被活化,诱导下游转录因子向细胞核转移定位,调节转录因子的活性,对靶基因转录和下游的炎症反应起着重要的调控作用。NF-κB是调控炎症反应的关键转录因子之一,直接调控炎症因子的基因转录,从而在引发炎症瀑布效应中发挥着重要作用。Klotho具有抗衰老和炎症损伤作用,文献研究发现可作为一种抗炎症调节剂,抑制炎症因子的分泌。但Klotho蛋白确切的抗炎症机制并不清楚。我们假设在缺血再灌注诱导的AKI中,缺血缺氧可能激活细胞内MAPK信号,进一步使转录因子NF-κB活化,引起下游炎症因子的释放和炎症细胞的活化聚集。外源性补充可溶性Klotho蛋白,可能可以通过抑制p38MAPK和下游的NF-κB通路,改善I/R损伤导致的肾功能受损和炎症反应。目的:探讨P38MAPK及NF-κB在I/R-AKI炎症反应的作用,以及Klotho蛋白通过对P38MAPK及NF-κB通路的抑制能够改善缺血再灌注损伤的炎症反应方法:体内实验:我们使用7-8周龄BALB/c雄性小鼠,5只采用双侧肾蒂夹闭法建立缺血再灌注损伤(IRI)模型(I/R组),5只小鼠在建立IRI前给予尾静脉注射Klotho蛋白(Klotho组),另5只小鼠作为对照组(sham组)。生化方法检测小鼠血清肌酐(serum creatinine,Scr)和尿素氮(blood urea nitrogen,BUN);HE染色观察肾组织损伤情况;免疫组化染色观察肾组织中肾损伤因子(KIM-1,tubular kidney injury molecule-1),巨噬细胞标识蛋白F4/80,MCP-1,磷酸化P38MAPK,磷酸化ERK1/2,磷酸化JNK和磷酸化P65的表达。Western blotting检测肾组织KIM-1、MCP-1、P38MAPK、p-P38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、P65、p-P65、Klotho蛋白表达变化体外实验:体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2),给予缺氧再复氧刺激(hypoxia/reoxygenation,H/R)。real-time PCR检查MCP-1 mRNA、Klotho mRNA的表达,Western blotting检测细胞P38MAPK、p-P38MAPK、P65、p-P65、MCP-1和Klotho蛋白的表达,免疫荧光检测p-P65,p-P38激活情况。结果:1、体内实验:sham组和I/R组小鼠的Scr分别是9.40±3.13umol/L和82.00±22.12umol/L,P<0.01,BUN的水平分别是10.20±1.13mmol/L和52.90±6.24mmol/L,P<0.01。Klotho组肾功能改善明显,肌酐和尿素氮分别是23.02±15.44umol/L和14.72±9.15 mmol/L,与I/R组比较,p均<0.01。缺血再灌注损伤降低了肾脏Klotho蛋白的表达,I/R组和sham组的肾脏Klotho蛋白表达分别是0.16±0.09和0.76±0.22,P<0.01。HE染色显示I/R组肾组织损伤严重,肾小管上皮细胞变性坏死,Klotho注射组肾组织损伤明显减轻,肾小管上皮细胞坏死减少。免疫组化染色显示,I/R组的KIM-1,巨噬细胞F4/80染色,MCP-1均较sham组增多。Western blotting提示I/R组肾组织中KIM-1的表达明显升高,较sham组升高1.75倍,P<0.01。免疫组化显示I/R组的p-P38MAPK表达增高主要集中在肾小管上皮细胞,p-ERK表达增多,主要位于肾脏间质细胞。肾小管上皮细胞核中p-P65表达增多。Western blotting显示I/R组肾脏磷酸化P38MAPK和磷酸化ERK表达较对照组分别增高153.39±22.20%和149.26±16.87%,P值为<0.01和0.02。磷酸化P65较sham组增加145.83±18.6%,P=0.02。Klotho组小鼠肾脏的p-P38MAPK,p-ERK,p-P65,MCP-1以及F4/80表达均较I/R组有改善。2、体外实验:人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞,缺氧24小时后复氧培养,随着复氧时间延长MCP-1 mRNA和蛋白,p-P38,p-p65的表达增高,复氧12小时(H24R12)达到最高。免疫荧光染色显示HK-2细胞核中p-P65绿色免疫荧光逐渐增多,在H24R12时表达最明显。P38MAPK抑制剂SB203580剂量依赖的抑制H/R培养HK-2细胞p-P38MAPK,MCP-1 mRNA和蛋白表达。NF-κB抑制剂BAY11-7082,剂量依赖地抑制H/R培养导致的MCP-1 mRNA和蛋白水平的上调。SB203580也可以剂量依赖地减少H/R培养引起的p-P65蛋白表达。外源可溶性Klotho可以浓度依赖的方式抑制H/R诱导的HK-2细胞高表达MCP-1基因和蛋白,p-P38MAPK表达以及p-P65的表达。免疫荧光染色也证明,Klotho蛋白(800pmol/L)使H/R培养的HK-2细胞p-P38MAPK表达减弱,细胞核中p-P65荧光信号减少。结论:1.在小鼠I/R肾损伤模型中,肾脏MCP-1表达增高,巨噬细胞增多。肾脏中磷酸化P38MAPK和磷酸化ERK表达增多。活化的P38MAPK表达在肾小管上皮细胞中,磷酸化ERK则表达在间质细胞中。P38MAPK信号诱导肾小管上皮细胞核中NF-κB亚基P65磷酸化增加。IRI导致肾脏中Klotho基因和蛋白表达减少,注射可溶性Klotho蛋白,可以改善I/R肾脏损伤,减轻组织学损伤。其机制可能是阻断了P38MAPK/NF-κB信号,减少炎症反应。2.H/R损伤可能诱导了肾小管上皮细胞分泌MCP-1,体外抑制P38MAPK和NF-κB活化可以抑制H/R诱导HK-2细胞表达MCP-1。补充外源性Klotho蛋白通过抑制P38MAPK和P65的活化,抑制H/R诱导的MCP-1高表达。