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研究背景和目的:肥大细胞(Mast cells,MC)和巨噬细胞(Macrophage,MΦ)是非常重要的免疫细胞,在机体固有免疫反应中具有举足轻重的作用。MC和MΦ具有极大的异质性。在人类MΦ既有分布于血液中以单核形式存在的状态,也有在多种组织和器官中分布的组织驻留型,并根据分布的形态和功能具有不同命名;而人类MC根据颗粒中含有蛋白酶种类不同,分为MCT和MCTc两类,前者与小鼠黏膜MC相似,后者与小鼠组织相关MC类似。MΦ和MC表面和内体分布多种Toll样受体(TLRs,一种机体内重要的模式识别受体),可有效识别病原体相关外源性危险信号(PAMPs)和自身细胞所释放的内源性危险信号(DAMPs),在机体防御中发挥着重要的作用。在个体发生的早期阶段,血细胞起源在顺序上有着时空分布的不同特征。所有血细胞均来源于中胚层,最早的造血细胞起源于卵黄囊;随后进入胚内的主动脉-性腺-中肾区域(AGM区),在此可产生最初的能够确认的造血干细胞;最后进入胎肝造血,在此含有大量可移植的造血干细胞。依据人体造血发生的时空顺序及不同特征,可将其分为原始造血和成体造血。在成体造血,所有功能型血细胞均来源于骨髓中的造血干细胞(Hematopoietic stem cells,HSCs)。然而,对小鼠胚胎造血发育的研究显示,起源于卵黄囊的原始造血以及红系/髓系祖细胞(EMP)都可产生MΦ。另外,在小鼠胎肝发育过程中发现MC前体高度集中于卵黄囊和胎肝血中,提示MΦ和MC存在一个较强的早期胚性发育阶段。研究发现,产生于早期胚性发育阶段的这两种固有免疫细胞具有组织偏向特性。由于受伦理道德及法律的限制,在人体中进行胚胎造血发育的研究存在诸多困难,导致对人类早期胚胎造血发生认识的缺失。对造血细胞发生学的研究主要基于小鼠等动物模型。但是动物体内的研究数据并不能完全指示人体内的发育过程。随着人胚胎干细胞(human embryonic stem cells,hESCs)的成功建系以及人诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)的体外重编程获得,为研究人类早期发育机制提供了有效的手段。hESCs和hiPSCs统称为人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs),具有自我更新、无限增殖及分化形成完整个体的能力,为研究跨胚层细胞、组织以及所有成体细胞的发育,提供了有效的手段。已有大量关于从hPSCs体外成功分化出三个胚层来源成熟细胞的报道。基于hPSCs向造血细胞诱导分化的研究,可很大程度上重现早期人类造血发生过程,有助于详尽地解析人类胚胎期造血的发育模式。为了研究人类早期发育过程中MC和MΦ的发育情况,从而更好地模拟体内早期发育,需要在体外建立一种高效地趋于自然发育过程的培养体系。通过与成体HSCs来源固有免疫细胞比较,我们研究了早期造血发育产生固有免疫细胞的功能及识别能力。在此,我们以人固有免疫细胞初期发育作为研究方向,重点探索hPSCs体外诱导产生MC和MΦ初期发育的起源及其功能。研究方法:基于hPSCs/AGM-S3共培养体系,建立固有免疫细胞体外培养方法。以MC和MΦ为主,分别检测两种固有免疫细胞的形态、表型特征以及功能,并探索两种细胞的起源。具体操作方法如下:1.以小鼠主动脉-性腺-中肾(Aorta-Gonad-Mesonephros,AGM)来源基质细胞系(AGM-S3),与hPSCs体外共培养,诱导产生大量造血干/祖细胞,进一步悬浮培养定向产生MΦ和MC。培养方法分为三步:1)将hPSCs细胞接种到AGM-S3上进行共培养,诱导造血分化发生,监测不同时间点克隆形态及表型分子表达变化,2)经悬浮培养一周,扩增造血干/祖细胞,3)更换培养基进行MC或MΦ定向分化。2.观察两种固有免疫细胞形态及表型特征1)MC形态学特征:麦格氏-吉姆萨(May-GrunwaldGiemsa,MGG)、酸性甲苯胺蓝(Acidictoluidineblue)以及阿尔新蓝(Alcian blue)化学染色观察细胞形态;电镜观察MC内颗粒形态;免疫荧光染色观察MC中Carboxypeptidase A、Cathepsin-G、Tryptase和Chymase蛋白酶的表达情况,多色流式检测技术分析MC表型分子表达谱系。2)MΦ形态学特征:MGG染色观察三种来源MΦ形态;多色流式检测技术分析三种来源MΦ表型分子表达谱系。3.检测两种固有免疫细胞功能1)MC功能检测:酶联免疫吸附法检测IgE、Substance P和Compound48/80刺激下,MC上清及细胞沉淀中组胺的含量;RT-qPCR方法检测TLRs表达。2)Φ功能检测:利用RT-qPCR方法检测不同极化条件下,炎症因子及TLRs表达;通过低密度脂蛋白(LDL)吞噬实验检测MΦ吞噬能力。4.寻找MC的祖细胞:利用流式分选技术(Fluorescence Activated Cell Sorting,FACS)分选目标细胞群,确定MC祖细胞结果:1.建立高效的hPSCs/AGM-S3共培养造血细胞诱导分化体系,可产生大量高纯度MC和初期MΦ。1)共培养14天再向MC定向培养10天,体系中发现C-KIT+,CD45+,Tryptase+和Chymase+的MC,40天双阳比例高达98%。2)共培养3天再向MΦ定向培养14天,可产生初期MΦ。2.产生的两种固有免疫细胞具有组织偏向型1)化学染色,免疫荧光染色,电镜观察以及IgE、SubstanceP和Compound48/80刺激下,MC都可释放组胺,确定我们的培养体系产生的MC为MCTC类型。2)初期产生MΦ在IL-4刺激可有效极化成M2型3.产生的两种固有免疫细胞与成体HSCs来源固有免疫细胞不同1)以外周血单个核细胞作为对照,与脐带血CD34+细胞来源的MC相比,hESCs/AGM-S3共培养产生的MC高表达TLR2,TLR4和TLR9。2)与脐带血CD34+细胞来源MΦ以及共培养14天来源MΦ相比,共培养3天来源MΦ表型分子具有明显不同的表达水平。IL-4刺激共培养3天来源MΦ中TLR1～TLR8基因表达水平明显高于前两种来源MΦ。4.产生的两种固有免疫细胞诞生于成体造血干/祖细胞(CD34+CD45+)之前1)流式分选共培养第8天CD34+C-KIT-和CD34+C-KIT+两群细胞,向MC定向培养14天,免疫荧光染色显示两亚群产生子代细胞Tryptase和Chymase双阳百分比都大于85%。2)共培养第3天产生的MΦD,诞生于成体造血干/祖细胞之前。结论:1.hPSCs/AGM-S3造血共培养体系可诱导产生MC和MΦ等固有免疫细胞,并且在成体造血干/祖细胞(CD34+CD45+细胞)诞生之前,可产生一群MC和MΦ。2.这群MC和MΦ具有自己独特的发育途径。3.这些初期产生的固有免疫细胞偏向于组织特性,高表达TLRs,说明分布于组织中的MC和MΦ具有更强的免疫识别能力,在固有免疫反应中发挥着重要的作用。