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研究背景鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma, NPC)是一种鼻咽上皮来源恶性肿瘤,流行于我国南方多省。目前NPC的治疗以放疗为主,化疗是最主要的辅助治疗方法。尽管放、化疗技术不断改进,但是NPC患者的疗效仍改善不明显。其中NPC细胞对化疗抵抗性的产生是影响NPC疗效的重要原因之一。因此寻找与NPC发生、发展及化疗敏感性密切相关的基因,通过对该类有效基因的检测和靶向调控,可以达到辅助诊断NPC、增加NPC的化疗敏感性、改善NPC的疗效、提高NPC患者的生存率等目的,具有潜在的临床应用价值。促红细胞生成素产生肝细胞受体A2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor EphA2)在多种肿瘤中表达上调,且其表达与肿瘤的病理分级、临床分期、转移、预后等密切相关,参与调控肿瘤细胞的生长、增殖、迁移、侵袭、转移等多项恶性生物学行为。目前,国内外有关EphA2的研究多集中在其对肿瘤细胞侵袭转移的影响,而EphA2对肿瘤细胞化疗敏感性的调控国内外报道甚少。紫杉醇为鼻咽癌常用化疗药物,靶向调控其化疗敏感性有助于提高NPC的疗效。本研究将分以下三个阶段探讨EphA2在NPC生长、增殖、侵袭过程中的作用,并重点研究EphA2对NPC紫杉醇化疗敏感性的调控作用及其分子机制。第一章EphA2在鼻咽癌中的表达及其临床意义目的：检测EphA2在NPC组织和细胞株中的表达水平,探讨EphA2的表达与NPC临床病理特征的相关性。方法：利用Western Blot技术检测47例NPC新鲜组织标本和21例鼻咽非肿瘤新鲜组织标本以及NPC细胞株中EphA2蛋白的表达水平,统计分析EphA2的表达与NPC临床病理特征的相关性。结果：EphA2蛋白在NPC组织中的表达较鼻咽非肿瘤组织中的表达明显升高,在NPC细胞株中也呈现高表达,且EphA2蛋白的表达水平与NPC的T分级(P=0.028)、临床分期(P=0.004)和颈部淋巴结转移(P=0.012)密切相关,组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：EphA2蛋白在NPC组织和细胞中表达升高,EphA2蛋白的表达与NPC患者的T分级、临床分期以及颈部淋巴结转移密切相关,提示EphA2在NPC的发生、发展过程中可能具有重要作用。第二章沉默和上调EphA2的表达对鼻咽癌细胞增殖、细胞周期及侵袭能力的影响目的：观察调控EphA2的表达对NPC细胞的增殖、凋亡、细胞周期及侵袭能力等生物学行为的影响。方法：利用慢病毒载体介导的EphA2shRNA(EphA2shRNA-LV)和EphA2基因过表达克隆(EphA2cDNA-LV)转染NPC5-8F细胞,利用嘌呤霉素筛选建立稳定沉默和过表达EphA2蛋白的细胞系,Western Blot验证EphA2蛋白沉默和上调效果。CCK-8法分别检测EphA2沉默和过表达前后细胞的生长抑制率,流式细胞术分别检测EphA2沉默和过表达前后细胞的凋亡率及细胞周期,Transwell侵袭实验检测EphA2沉默后细胞侵袭能力的改变。结果：1.慢病毒介导的RNA干扰和过表达克隆技术成功沉默和上调NPC5-8F细胞中EphA2的表达,并建立了稳定沉默和过表达EphA2的细胞系。2.沉默EphA2蛋白的表达减弱5-8F细胞的体外增殖能力,72h开始EphA2沉默组细胞与对照组细胞生长抑制率有统计学差异(P<0.05)；上调EphA2蛋白的表达增强5-8F细胞的体外增殖能力,72h始EphA2上调组细胞与对照组细胞生长抑制率比较,有统计学差异(P<0.05)。3.EphA2沉默组与对照组比较,G0/G1期细胞比例(%)(沉默组：74.38±3.71VS对照组：53.82±2.19)明显增加,而S期细胞比例(沉默组：17.89±2.21VS对照组：30.41±1.55)和G2/M期细胞比例(沉默组：7.72±2.24VS对照组：15.80±3.72)则显著降低,组间差异均具有统计学意义(P<0.05)。上调EphA2表达,G0/G1期细胞比例较对照组明显降低(上调组47.39±3.75VS53.89±2.22),差异具有统计学意义(P<0.05)；而S期细胞比例(38.80±7.11VS38.63±4.15)无明显差异(P>0.05),G2/M期细胞比例则较对照组增加(14.15±3.00VS7.81±2.36),差异具有统计学意义(P<0.05)。沉默EphA2的表达,细胞的凋亡率(%)较对照组无明显差异(P>0.05),而EphA2过表达细胞的凋亡率较对照组减少(4.94±1.45VS8.99±0.84),差异具有统计学意义(P<0.05)4.沉默EphA2的表达,5-8F细胞的体外侵袭能力较对照组明显减弱(穿过小室到下室面的细胞数：沉默组：59±4VS对照组：103±12),差异具有显著统计学意义(P<0.01)。结论：EphA2通过影响NPC细胞的周期进展调控其体外增殖能力,并能影响NPC细胞的体外侵袭能力,提示EphA2在NPC的发展和心恶性进展过程中发挥重要作用。第三章EphA2对鼻咽癌细胞紫杉醇化疗敏感性的调控作用及其分子机制目的：探讨EphA2对NPC细胞紫杉醇化疗敏感性的影响及其分子机制。方法：基因过表达克隆EphA2cDNA和EphA2vector质粒瞬时转染5-8F细胞,72h后Western Blot技术检测EphA2的表达水平。梯度浓度紫杉醇分别作用于稳定沉默EphA2表达的5-8FEphA2-RNAi+细胞及5-8F细胞和瞬时转染上调EphA2表达的5-8FEphA2cDNA+细胞、5-8FEphA2vector细胞及5-8F细胞,48h后CCK-8法检测各孔的吸光度(OD)值,计算各组细胞生存率和紫杉醇IC50浓度。IC30浓度紫杉醇分别作用于5-8FEphA2cDNA+细胞、5-8FEphA2vector组及5-8F细胞,48h后流式细胞术检测各组细胞凋亡率和细胞周期,Western Blot技术检测各组细胞中EphA2、细胞周期调控蛋白(CDK2、Cyclin E、p21、 p27、Rb和p-Rb)和PI3-K/Akt信号通路蛋白(Akt、p-Akt、GSK-3β、p-GSK-3p)的表达水平。以20nM、10nM和0nM浓度的P13-K/Akt抑制剂LY294002分别处理5-8FEphA2.DNA+细胞后,再予以梯度浓度紫杉醇处理,48h后CCK-8法检测各孔吸光度(OD)值,计算各浓度抑制剂处理组细胞生存率,绘制细胞生存曲线,得出紫杉醇的IC30后,再以IC30的紫杉醇作用于以20nM、10nM和0nM浓度的P13-K/Akt抑制剂LY294002处理过的5-8FEphA2.DNA+细胞,Western Blot检测各组EphA2.P13-K/Akt信号通路蛋白和细胞周期调控蛋白的表达水平,流式细胞术检测各组细胞周期和凋亡率的变化。结果：1.基因过表达克隆EphA2cDNA质粒瞬时转染5-8F细胞,成功上调EphA2的表达,并建立了EphA2过表达的5-8F瞬转细胞系。2.紫杉醇作用于5-8FEphA2RNAi+细胞和5-8F细胞的IC50值分别为1.6nM和5.6nM,5-8FEphA1RNAi+细胞对紫杉醇作用的敏感性较5-8F细胞明显增加(P<0.05)；紫杉醇作用于5-8FEphA2cDNA+、5-8FEphA2vector及5-8F细胞,各组紫杉醇的IC50值分别为5nM、0.7nM、0.6nM,5-8FEphA2cDNA+细胞对紫杉醇的敏感性较5-8FEphA2vector及5-8F细胞明显降低(P<0.05)。3.IC30紫杉醇作用于5.8FEphA2cDNA+细胞.5-8FEphA2vector细胞及5-8F细胞,流式细胞检测各组凋亡率(%)分别为：9.84±2.08、8.66±1.59、7.74±1.34,两两比较,差异均无明显统计学意义(P>O.05).5-8FEphA2cDNA+组细胞较5-8Fvector组和5-8F组G0/G1期细胞比例明显减少(分别为45.25±3.89VS65.85±2.28、64.52±3.31),差异具有统计学意义(P<0.05),而S期细胞比例(分别为31.56±1.59VS25.76±1.89、24.55±3.64)和G2/M期细胞比例(分别为23.10±4.55VS8.39±0.8K10.94±3.27)则明显增多,差异具有统计学意义(P<0.05);5-8Fvector细胞与5-8F细胞比较,各周期细胞比例无明显统计学差异(P>0.05)。4.EphA2的过表达,可以抑制紫杉醇作用后的5-8F细胞中周期进展阻滞蛋白p21和p27的表达；引起细胞周期抑制蛋白Rb的表达活化、p-Rb表达水平增高；同时可以引起5-8F细胞中p-Akt表达上调,而Akt的表达总量不变,但是对细胞周期启动蛋白CDK2和CyclinE蛋白的表达无明显影响。5.PI3-K/Akt抑制剂LY294002可以抑制Akt和GSK-3β的磷酸化导致p-Akt和p-GSK-3β的表达下调,但是Akt和GSK-3β的表达总量不变；同时细胞周期进展阻滞蛋白p21和p27的表达升高,而促细胞周期进展蛋白p-Rb的表达水平下调,细胞周期启动蛋白CDK2和Cyclin E的表达无明显改变。20nM、10nM和0nM浓度的PI3-K/Akt抑制剂LY294002处理IC30浓度紫杉醇干预的5-8FEphA2cDNA+细胞,20nM和10nM抑制剂处理组细胞凋亡率分别为：9.55±0.84和9.92±2.13,较不加抑制剂(0nM)组细胞凋亡率(11.67±2.30)低,但差异无统计学意义(P>0.05)；20nM和10nM抑制剂处理组G0/G1期细胞比例分别为：65.69±2.78、58.61±2.13,较不加抑制剂(0nM)组G0/G1期细胞比例(46.62±1.77)明显增加,差异有统计学意义(P<0.05),而S期细胞(20nM组：24.37±3.70,10nM组：27.08±2.19,0nM组：32.14±1.98)和G2/M期细胞(20nM组：9.94±3.97,10nM组：14.31±1.61,0nM组：21.24±1.47)则明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。PI3-K/Akt抑制剂LY294002使5-8FEphA2cDNA+细胞对紫杉醇作用的敏感性增加。结论：EphA2通过PI3-K/Akt/GSK-3β介导的信号通路影响细胞周期调控蛋白的表达,进而调控NPC细胞对紫杉醇化疗的敏感性。EphA2可能作为有效的分子靶点应用于调控NPC对紫杉醇化疗的敏感性,对提高NPC的疗效具有重要意义。