【摘 要】
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目的:静止期癌细胞暂时处于休眠状态,能够在细胞微环境适宜时重新增殖,导致癌症的复发。静止期癌细胞对于化疗药物耐受,是导致化疗效果不佳的原因之一。目前临床上还没有靶向静止期癌细胞的治疗药物。本研究利用前期建立的抑制静止期癌细胞的小分子筛选平台,从中药小分子中筛选得到能够特异性杀死静止期前列腺癌细胞的化合物柴胡皂苷A（SSA）,并拟对其诱导静止期癌细胞的作用机制进行深入的研究。同时,在化疗间歇期将SS
【基金项目】
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国家自然科学基金（No.81803571）:天然化合物Guttiferone K调节线粒体核糖体蛋白选择性杀死静止期前列腺癌细胞的机理研究； 国家自然科学基金-云南联合基金重点项目（No.U1902213）:藤黄科植物中天然PPAP类抗肿瘤先导化合物的挖掘；
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目的:静止期癌细胞暂时处于休眠状态,能够在细胞微环境适宜时重新增殖,导致癌症的复发。静止期癌细胞对于化疗药物耐受,是导致化疗效果不佳的原因之一。目前临床上还没有靶向静止期癌细胞的治疗药物。本研究利用前期建立的抑制静止期癌细胞的小分子筛选平台,从中药小分子中筛选得到能够特异性杀死静止期前列腺癌细胞的化合物柴胡皂苷A（SSA）,并拟对其诱导静止期癌细胞的作用机制进行深入的研究。同时,在化疗间歇期将SSA与多西他赛联合使用,对联合用药的治疗效果进行评估,为SSA作为临床化疗辅助用药的应用前景提供理论依据。方法:（1）通过流式表面抗原（ki-67）染色技术和免疫组织化学染色的方法,验证前列腺癌的一线用药多西他赛在体内外对于前列腺癌细胞群体中静止期癌细胞存活比例的影响;（2）运用静止期前列腺癌细胞模型,采用SYBR Green实验,PI外排实验以及细胞存活率检测实验（FVD）,检测SSA及化疗药物对于静止期癌细胞与增殖期癌细胞以及非癌细胞株存活率的影响,验证SSA对于静止期前列腺癌细胞具有选择性的细胞毒作用;（3）运用PI/Annexin V双染的流式实验和TUNEL染色法,检测SSA在静止期前列腺癌细胞中诱导凋亡的作用;（4）构建GFP-LC3转染的细胞株LNCa P和PC-3并对LAMP-1蛋白进行免疫荧光染色,检测SSA在静止期前列腺癌细胞中诱导自噬的作用;（5）使用凋亡抑制剂,自噬抑制剂和诱导剂等干预细胞,探索SSA诱导静止期前列腺癌细胞死亡的主要方式;（6）运用蛋白免疫印迹实验,检测自噬通路及Akt/m TOR通路的相关蛋白表达量,探索SSA在静止期前列腺癌细胞中调控上述信号通路的作用;（7）运用Akt抑制剂和构建AKT1过表达的细胞株,检测Akt蛋白通路对于SSA诱导静止期前列腺癌细胞死亡的影响;（8）体内外将SSA与多西他赛进行时序性联用,通过细胞存活率检测实验和裸鼠体内移植瘤实验,检测SSA与多西他赛联合使用时对肿瘤治疗效果的影响。结果:体内外的免疫组化和流式表面抗原（ki-67）染色实验结果表明,多西他赛处理能够增加前列腺癌细胞群体中静止期癌细胞的比例。同时,静止期前列腺癌细胞对于五种常用的化疗药物耐受,表现出较强的多药耐药性。前期药物筛选的结果显示,来源于中药柴胡的小分子化合物柴胡皂苷A能够特异性杀死化疗药物耐受的静止期前列腺癌细胞,且SYBR Green实验和细胞存活率检测实验结果表明,该剂量下对增殖期的前列腺癌细胞及非癌细胞株没有明显的细胞毒性。10μM的SSA作用24小时,能够显著诱导静止期前列腺癌LNCa P,PC-3和DU145细胞的死亡;而20μM的SSA作用72小时,对增殖期的三种前列腺癌细胞,以及人前列腺基质细胞WPMY-1和人肝上皮细胞HL7702没有明显的细胞毒作用。通过PI/Annexin V双染的流式实验和TUNEL染色法,发现SSA能够在静止期前列腺癌细胞中诱导一定程度的凋亡,但是加入凋亡抑制剂干预后并不能明显的逆转SSA诱导的细胞死亡,表明SSA诱导静止期癌细胞死亡的主要方式并非通过诱导细胞凋亡。进一步的蛋白免疫印迹实验结果表明,SSA能够在静止期前列腺癌细胞中诱导p62蛋白的降解和LC3蛋白I型向II型的转变,表明SSA在静止期前列腺癌细胞中诱导了细胞自噬。通过建立稳定转染GFP-LC3的细胞株,发现SSA在静止期前列腺癌细胞中增加GFP绿色荧光斑点的聚集,且诱导LC3指示的自噬小体与LAMP1蛋白指示的溶酶体发生共定位,说明SSA促进了自噬小体和溶酶体的融合。自噬抑制剂不仅能显著逆转SSA诱导的细胞死亡,同时也逆转了SSA诱导的细胞调亡,表明SSA诱导的静止期癌细胞的死亡方式主要为自噬性细胞死亡。进一步机制研究表明,SSA能够降低静止期前列腺癌细胞中Akt/m TOR通路上的p-Akt（Ser473）和p-rp S6（Ser235/236）蛋白的表达。通过运用Akt抑制剂和稳定过表达AKT1的细胞株,进一步证明SSA通过调控Akt/m TOR通路,从而诱导静止期前列腺癌细胞发生细胞自噬。在多西他赛的化疗间歇期时序性联用SSA,体外实验结果表明联用能够明显增强细胞毒作用,体内动物实验结果表明联用能够增强抗肿瘤效果。给药后21天牺牲动物时,对照组的裸鼠肿瘤体积平均值为1050.1mm~3,多西他赛单用组瘤体积平均值为579.9 mm~3,而联用组的肿瘤体积平均值为293.4 mm~3。联用组的肿瘤大小和重量均显著低于对照组和多西他赛单用组,证明SSA与多西他赛联用能显著抑制肿瘤生长,且联用显著增强化疗药物的作用。结论:中药柴胡中的柴胡皂苷A（Saikosaponin A）能够选择性诱导化疗药物耐受的静止期前列腺癌细胞死亡,其机制是通过调控Akt/m TOR通路诱导细胞自噬性死亡,进而导致细胞凋亡。柴胡皂苷A与多西他赛时序性联合使用,能够显著增强化疗效果,具有成为靶向静止期癌细胞的新型肿瘤治疗药物的潜力。
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