论文部分内容阅读
研究背景放射治疗是目前肿瘤临床综合治疗的重要手段之一,大约50%以上的肿瘤患者需要接受放射治疗,然而肿瘤细胞内在的放射抵抗性和放射治疗后肿瘤细胞再增殖是肿瘤放射治疗的主要障碍,极大地限制了放射治疗的潜在价值。因此增强肿瘤细胞的放射敏感性和抑制肿瘤细胞的再增殖能够有效地提高肿瘤放射治疗的临床效果。放射治疗杀伤肿瘤细胞的主要机制是基因组DNA双链断裂(Double Strand Breaks, DSBs),导致细胞失去增殖能力,然而肿瘤细胞具有较强的DNA DSBs修复能力,直接导致肿瘤细胞的放射抵抗性。同源重组(Homologous Recombination, HR)和非同源末端连接(Non-Homologous End Joining, NHEJ)是哺乳动物细胞修复DNA DSBs的两个分子通路,调控DNA DSBs修复通路的关键蛋白能够增强肿瘤放射治疗的敏感性。XRCC2和XRCC4基因分别是HR和NHEJ修复通路的关键蛋白,两者可能是调控肿瘤放射敏感性的重要靶点。MicroRNAs (miRNAs)是由约19～23个核苷酸组成的内源性的具有调控功能的非编码RNA,通过不完全的碱基配对识别靶基因3’端非翻译区,降解靶基因信使RNA (messenger RNA, mRNA)或(和)阻遏其转录后翻译。由于人工合成的miRNA (artificial miRNA, amiRNA)能够减轻短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)介导的细胞毒性,近年来已广泛地应用于特异性沉默靶基因的表达及其功能研究。基于amiRNA的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术已经成为肿瘤靶向性治疗的基本工具,并有望成为肿瘤治疗和临床研究的一种新策略。第一部分RNAi靶向DNA修复基因编码与非编码序列增敏放疗目的：构建靶向HR和NHEJ修复通路关键蛋白XRCC2和XRCC4的amiRNAs,研究特异性amiRNAs对肿瘤细胞XRCC2和XRCC4基因的抑制作用,并观察其对肿瘤细胞放射敏感性的影响；应用amiRNA和siRNA联合靶向XRCC2和XRCC4的非编码序列和编码序列,观察是否能够更有效地抑制基因表达并促进肿瘤细胞对放射线的敏感性,并且分析其抑制基因表达的作用机制,旨在探讨以XRCC2和XRCC4为靶点的肿瘤放射增敏治疗的可行性,以及amiRNA和siRNA联合介导的RNA干扰技术特异性沉默基因表达的有效性。方法和材料：根据BLOCK-iTTM Pol Ⅱ miR RNAi表达体系,设计并合成靶向XRCC2和XRCC4非编码序列的特异性互补DNA寡核苷酸,退火形成双链DNA寡核苷酸,应用Gateway技术重组入pLenti6/V5-DEST载体,构建amiRNA表达质粒pLenti6/V5-GW/EmGFP-miR;荧光素酶分析amiR-XRCC2和amiR-XRCC4与靶基因非编码序列结合的特异性；与病毒包装质粒共转染293FT细胞,收集上清,利用慢病毒介导amiRNA表达质粒转染胶质母细胞瘤细胞U87MG和肺癌细胞A549,通过Western blot检测XRCC2和XRCC4的蛋白表达水平,验证amiRNA作用的有效性。抗生素Blasticidin筛选稳定表达amiR-XRCC2和amiR-XRCC4的U87MG和A549细胞,给予不同剂量X射线照射,通过细胞免疫荧光方法检测y-H2AX表达变化观察DNA双链断裂的修复,克隆形成实验检测amiRNA抑制XRCC2和XRCC4基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响。利用XRCC2和XRCC4的特异性siRNA,转染稳定表达amiR-XRCC2和amiR-XRCC4的U87MG和A549细胞72小时,通过Western blot检测其对XRCC2和XRCC4蛋白表达的影响,克隆形成实验检测amiRNA表达质粒与siRNA联合抑制XRCC2和XRCC4基因表达对肿瘤细胞放射敏感性的影响；合成针对XRCC2和XRCC4的特异性amiRNA mimic,与siRNA共转染U87MG和A549细胞72h后,应用实时定量PCR和Western blot检测XRCC2和XRCC4的mRNA和蛋白水平,克隆形成实验检测两者共转染联合抑制XRCC2和XRCC4基因对肿瘤细胞放射敏感性的影响。结果：人胶质母细胞瘤和肺癌中DNA修复基因XRCC2与XRCC4的表达明显高于正常细胞和组织；构建的amiR-XRCC2与amiR-XRCC4能够分别特异性地作用于基因的3’非编码序列,并分别有效地抑制U87MG和A549肿瘤细胞中XRCC2与XRCC4基因的表达,从而增加了肿瘤细胞对放射线的敏感性,而且两者联合作用的效果明显优于单独作用；amiR-XRCC2和amiR-XRCC4转染U87MG和A549后细胞的生长增殖速率无明显改变；与稳定转染amiR-Vector的U87MG和A549细胞对照组相比,稳定转染amiR-XRCC2或amiR-XRCC4的细胞经X射线照射30min后,两组细胞中γ-H2AX的阳性率明显高于对照组,但该两组细胞之间的阳性率无明显区别,而联合转染amiR-XRCC2和amiR-XRCC4细胞中γ-H2AX的阳性率明显高于单独转染amiR-XRCC2或者amiR-XRCC4的细胞。XRCC2或XRCC4特异性siRNA转染稳定表达amiR-XRCC2或amiR-XRCC4的U87MG和A549细胞,转染后72小时对XRCC2和XRCC4蛋白水平的抑制作用最明显,而且siRNA转染后能够有效地增加稳定表达amiR-XRCC2和(或)amiR-XRCC4细胞的放射敏感性。化学合成XRCC2和XRCC4的特异性amiR mimics,分别与XRCC2和XRCC4的特异性siRNA共转染U87MG和A549细胞,两种小RNA的联合应用能更有效地抑制蛋白表达并增加肿瘤细胞的放射敏感性。与siRNA转染组比较,amiR mimic转染组中XRCC2和XRCC4基因的蛋白抑制水平(-70%)无明显区别,但其mRNA表达水平明显低于前者(-30%VS-65%)；与siRNA转染组比较,amiR mimic与siRNA联合转染能更有效地减少蛋白表达,但并不进一步降低mRNA的稳定性,说明amiR mimic能同时通过降低mRNA稳定性和阻断蛋白翻译来抑制基因的表达。结论：抑制肿瘤细胞中DNA修复蛋白XRCC2和XRCC4的表达,可增强肿瘤细胞DNA的X射线损伤作用,并有效地增加肿瘤细胞对X射线治疗的敏感性。联合amiRNA和siRNA的小RNA干扰技术分别靶向XRCC2与XRCC4的非编码区和编码区能更有效地抑制蛋白表达并增强肿瘤细胞的放射敏感性。从机制上来讲,该联合基因沉默方法是通过降低靶基因mRNA的稳定性和阻遏蛋白质的翻译两条途径抑制靶基因的表达。本研究建立了一种更加有效的基因沉默方法,尤其适用于抑制应用amiRNA或者siRNA干扰难以沉默的基因。第二部分重离子辐射和人工miRNA联合靶向同源重组修复基因有效杀伤肿瘤细胞目的：与常规射线放疗相比,重离子放疗因其物理学和生物学效应优势使其成为肿瘤放射治疗领域最理想的放疗方法。重离子束照射细胞后,沿自身轨迹产生致密电离造成细胞无法修复的集簇性DNA损伤,并且改变细胞的超微结构,而这些大量集簇性的小的DNA片段干扰非同源末端连接修复,但不影响同源重复修复。重离子辐射治疗肿瘤临床试验的优异疗效,促使重离子治疗与其他治疗方式的联合治疗越来越受到关注,尤其是与分子靶向治疗以及化学制剂相结合,增强对肿瘤细胞的杀伤。前期研究中我们构建的靶向抑制DNA双链断裂修复基因XRCC2和XRCC4的amiRNA可有效地抑制其在肿瘤细胞中的蛋白表达并促进肿瘤细胞对X射线的敏感性。鉴于此,本研究将采用amiR-XRCC2抑制同源重组修复通路联合重离子辐射治疗观察是否能够能加有效地杀死肿瘤细胞。方法和材料：体外培养人胶质母细胞瘤U87MG细胞和肺癌A549细胞,以及稳定表达amiR-Vector、amiR-XRCC2、amiR-XRCC4和amiR-XRCC2/XRCC4的U87MG和A549细胞。皮下注射稳定转染amiRNA的肿瘤细胞构建裸鼠移植瘤模型。对细胞和移植瘤分别给予低LET和高LET射线照射。低LET照射是采用X射线,输入电压320V,输入电流10mA,细胞照射剂量率为2Gy/min,移植瘤照射剂量率为1Gy/min。高LET照射是采用Fe离子束,能量为1GeV/amu,细胞和移植瘤照射剂量率为1Gy/min。细胞射线照射后通过克隆形成实验检测肿瘤细胞的放射敏感性。移植瘤射线照射治疗后一周,处死裸鼠,取瘤称重,同时采用免疫组织化学方法检测移植瘤中XRCC2和XRCCR4的表达水平。结果：与amiR-Vector组相比,amiR-XRCC2和amiR-XRCC4组U87MG和A549细胞对低LET射线的敏感性增强,amiR-XRCC2组肿瘤细胞对高LET射线的敏感性增强,而amiR-XRCC4组肿瘤细胞对高LET射线的敏感性无明显改变。与amiR-XRCC2组相比,amiR-XRCC2/4组细胞对低LET射线的敏感性增强,而对高LET射线的敏感性无明显改变。与XRCC4组比较,amiR-XRCC2/XRCC4组细胞对低LET和高LET射线的敏感性均增强。低LET与高LET射线照射均能够缩小肿瘤体积,而且后者较前者的体积更小。X射线照射后,amiR-XRCC2和amiR-XRCC4组肿瘤的体积明显小于空载体组,而重离子束照射后,amiR-XRCC2组肿瘤的体积明显小于空载体组,而amiR-XRCC4组肿瘤的体积与空载体组比较无明显差别。与体外实验的结果类似,与amiR-XRCC2或amiR-XRCC4组相比,amiR-XRCC2/XRCC4组肿瘤体积经低LET射线照射后明显缩小,与amiR-XRCC2组比较,amiR-XRCC2/XRCC4组肿瘤体积经高LET射线照射后无明显改变。结论：抑制非同源末端连接修复蛋白XRCC4和同源重组修复蛋白XRCC2能够在体外和体内增加肿瘤细胞对低LET射线的敏感性,而且抑制：XRCC2而非XRCC4能够有效地促进肿瘤细胞对高LET照射的放射敏感性。抑制同源重组修复联合高LET射线照射,能够有效地提高放射线诱导的肿瘤杀伤。