论文部分内容阅读
目的:通过二代高通量测序技术,对桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)患者外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)miRNAs的表达谱进行分析,运用生物信息学方法预测分析,筛选出与HT发病相关的miRNAs进行验证,并进一步研究其调控机制;探讨miRNA作为HT潜在生物标志物可能性,为HT的临床诊治提供新思路。方法:1、运用二代高通量测序技术分别检测5例HT患者和5例健康志愿者PBMCs中的RNA并构建测序文库,利用生物信息学进行计算分析得出,获得miRNAs差异表达谱。2、从miRNAs的表达谱中挑选出与HT发病机制可能相关且具有一定研究价值的六个miRNAs,扩大样本量,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative reverse transcription polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术验证测序结果。3、运用基因本体论(Gene Ontology,GO)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)Pathways对差异表达的miRNAs的潜在靶基因进行功能分析,预测潜在的生物学功能及可能参与的生物学过程。4、利用Targetscan/miRanda数据库对HT患者中显著差异表达的miRNAs进行靶基因预测,筛选出可能参与HT发病的潜在靶基因。5、采用qRT-PCR技术检测HT患者PBMCs中miR-125a-5p潜在靶基因MAF的表达水平,并分析其与miR-125a-5p表达水平之间的关系。体外运用双荧光素酶报告基因技术及干扰RNA技术验证miR-125a-5p与MAF之间的靶向关系。6、通过流式细胞术(Flow cytometry,FCM)分别检测HT患者组与健康者组外周血PBMCs中Th1细胞百分比差异,同时运用qRT-PCR技术检测两组中Th1细胞相关因子IFNG mRNA表达差异,并分析HT患者PBMCs中miR-125a-5p与Th1细胞百分比及IFNG mRNA之间的关系。7、采用磁珠分选的方法分选出健康志愿者外周血CD4~+T细胞,转染NC或者miR-125a-5p抑制剂后,采用qRT-PCR技术检测转染后miR-125a-5p、MAF mRNA及IFNG mRNA表达水平的变化,运用FCM技术检测转染后CD4~+IFN-?~+T细胞、CD4~+IL-4~+T细胞比例变化。8、分析HT患者PBMC中miR-125a-5p的表达水平与血清中自身抗体抗甲状腺过氧化物酶抗体(anti-thyroperoxidase antibody,TPOAb)水平和抗甲状腺球蛋白抗体(anti-thyroglobulin antibody,TgAb)水平的关系;并采用qRT-PCR技术验证甲状腺组织中miR-125a-5p、MAF mRNA及IFNG mRNA表达情况。9、采用ROC曲线分析HT显著差异表达的miRNAs其对HT的诊断价值。结果:1、通过高通量测序技术构建HT患者和健康志愿者外周血PBMCs中miRNAs表达谱,发现HT患者共有1310个miRNAs差异表达,其中659个miRNAs上调,651个miRNAs下调;其中显著差异表达的miRNAs有22个(Fold-change≥1.5,p≤0.05),上调的miRNAs和下调的miRNAs分别有12个、10个。2、从miRNAs表达谱中挑选出与HT发病机制可能相关且具有一定研究价值的六个miRNAs,运用定量PCR验证其表达变化,结果显示其中miR-132-5p、miR-301a-5p、miR-125a-5p相对表达显著上调,miR-146b-3p相对表达显著下调,与测序结果一致。3、对HT患者中差异表达的miRNA潜在靶基因的生物学功能进行预测及分析:GO分析显示,上调的miRNA靶基因中,在分子功能中显著富集的条目有24条,在细胞组分方面显著富集的GO条目有13条,而在生物学过程显著富集的GO条目有131条;而下调的miRNA靶基因中,在分子功能方面显著富集的GO条目有38条,在细胞组分方面显著富集的GO条目有30条,在生物学过程方面显著富集的GO条目有199条。Kegg Pathways分析显示,表达上调miRNAs靶基因可能参与的信号通路有18条、表达下调miRNAs靶基因可能参与的信号通路有16条。4、对于高通量测序验证结果一致的四个miRNAs,采用数据库预测分析潜在的靶基因,结合文献,筛选出可能与HT发病机制相关的miRNA潜在靶基因MAF,且在HT患者PBMCs中MAF mRNA的表达水平明显下调(p<0.05),并与其对应的miR-125a-5p表达水平呈负相关。荧光素酶报告基因证实了miR-125a-5p与MAF基因两者之间存在着靶向关系。体外转染实验发现转染miR-125a-5p抑制剂组的健康人PBMCs与转染NC组相比,MAF mRNA的表达量明显增加,MAF~+细胞比例也明显增加,这些结果均提示miR-125a-5p可以靶向抑制MAF的表达。5、通过FCM检测发现Th1细胞比例在HT患者PBMCs中比健康对照组中明显增多[(19.86±2.78)%vs(13.77±1.13)%,p<0.05]。同样的Th1细胞的相关因子IFNG mRNA在HT患者PBMCs中相对表达水平也明显增高(0.22±0.21 vs0.13±0.12,p<0.01)。相关性分析发现HT患者PBMCs中miR-125a-5p相对表达量与Th1细胞百分比(r=0.4737;p=0.0224)呈明显正相关,而与IFNG mRNA没有相关性(r=-0.1429;p=0.5157)。6、转染miR-125a-5p抑制剂组的健康人CD4~+T细胞与转染NC相比,miR-125a-5p和IFNG mRNA相对表达量明显降低,而MAF mRNA相对表达量增加;此外发现转染miR-125a-5p抑制剂组CD4~+细胞中IFN-?~+T细胞百分比明显减少,而IL-4~+T细胞百分比无明显变化。7、HT患者外周血miR-125a-5p的相对表达量与TPOAb水平(r=0.4979,p=0.0156)存在明显正相关,而与TgAb水平(r=0.3926,p=0.0639)没有相关性。相比较于单纯性甲状腺肿患者,HT患者甲状腺组织中miR-125a-5p表达明显增加(0.17±0.13vs 0.05±0.03,p<0.05),且HT患者甲状腺组织中IFNG mRNA表达水平亦明显增加(0.07±0.05 vs 0.01±0.01,p<0.01),而HT患者甲状腺组织中MAF mRNA相对表达量明显减少(0.08±0.03 vs 0.19±0.13,p<0.05)。8、ROC曲线分析评估HT患者外周血中显著差异表达的miRNAs的潜在诊断价值,与miR-301a-5p,miR-132-5p和miR-146b-3p相比,miR-125a-5p AUC面积最大,为0.744(95%CI=0.606-0.833,p=0.004),其敏感性为72.91%,特异性为68.00%。结论:1、运用高通量测序的方法构建出HT患者与健康志愿者外周血PBMCs的差异表达的miRNAs表达谱。2、挑选6个差异表达的miRNAs,运用qRT-PCR技术扩大样本量进行验证,结果与测序结果基本保持一致,证实了高通量侧学结果准确性。3、通过GO分析与KEGG Pathyway分析预测HT患者中差异表达miRNAs潜在靶基因的生物学功能及可能参与的生物学过程。4、miR-125a-5p通过直接靶向MAF来影响Th1细胞的反应。体外干扰人外周血CD4~+T细胞中miR-125a-5p水平会引起IFNG mRNA表达水平下调和CD4~+IFN-?~+T细胞比例减少;HT患者体内miR-125a-5p的表达水平与患者自身抗体TPOAb水平存在显著正相关,这些都提示miR-125a-5p可能与HT的发生有关系并在一定程度上反应了疾病的严重程度。