复苏植物旋蒴苣苔Boea hygrometrica抗逆相关热激蛋白及大片段DNA功能鉴定

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复苏植物旋蒴苣苔Boea hygrometrica生长在土壤含钙量高、干旱频繁发生和碱性土壤著称的喀斯特地区石灰质岩石上。为发掘植物耐逆相关的基因,本论文采用两种策略,一是利用旋蒴苣苔的大片段基因组DNA表达文库的转基因拟南芥群体耐逆性分析技术筛选可提高植物耐逆性的文库克隆,二是从EST库中发现的受干旱诱导的热激蛋白基因中筛选可提高植物耐逆性的基因,并对其进行功能分析。从大片段基因组DNA表达文库的转基因拟南芥群体中筛选到两个抗逆单克隆Bh1-78和Bh3-39,发现Bh1-78能够提高拟南芥的耐碱能力,Bh3-39能够提高拟南芥的耐渗透胁迫能力及耐高钙和耐碱能力。野生型拟南芥和转基因株系在正常生长条件下没有明显差异,但在这些渗迫下转基因株系与野生型相比,表现为萎蔫率较低、主根较长、侧根较多。此外,抗逆克隆L1-4及其亚克隆S21转基因植物在土壤中也具有一定的干旱适应能力。这些表明,在这三个克隆中存在抗性基因或者遗传元件,能提高转基因株系的抗逆性。本论文针对旋蒴苣苔进行不同时间梯度的5种胁迫处理,研究6个热激蛋白(HSP)的基因表达方式。结果表明,其中2个小热激蛋白(sHSP)(Bh16.6CI和Bh35.9)、1个HSP70(BhHSP70-1)和2个HSP40(BhDNAJC1和BhDNAJC9)编码基因受CaCl2、NaCl、碱、甲基紫精(Methyl viologen,MV)、ABA诱导;1个HSP40基因BhDNAJC8在碱处理下表达下调,在其他四种处理下表达量上调;除氧化胁迫外,以上6个基因的表达量随着时间的增长而增强。这6个基因的过表达株系在不同胁迫下也表现出一定的抗逆性。以上结果表明,旋蒴苣苔热激蛋白(BhHSP)参与植物胁迫保护作用。此外,本论文还对HSP40家族J结构域蛋白BhDNAJC2的基因进行了序列、表达和亚细胞定位的研究。序列分析发现其属于类型III,但与该类型的其他成员相似度很低,是一个新HSP40成员。该蛋白含有与HSP70结合所需的J结构域,表明其功能可能需要与HSP70的互作。Real-time数据表明,该基因在低温、热激、ABA处理、氧化胁迫以及不同程度脱水和复水的叶片中表达均上调。过表达BhDNAJC2的拟南芥能在20%PEG、20μMABA、pH9.0、150mM NaCl、60mM CaCl2等不同处理下生长,PSII原初光能转化效率(FV/FM)与正常条件相比无明显变化,相对电导率下降。激光共聚焦显微镜观察表明BhDNAJC2-YFP融合蛋白主要定位在细胞质和细胞核中。因此推测该蛋白可能在低温、高温、盐碱胁迫、干旱和复水过程中起到保护细胞质和细胞核作用。综上所述,本论文鉴定了旋蒴苣苔基因组中在提高植物耐逆性方面有效的大片段DNA和7个HSP基因。这两种方法为培育耐逆性提高的作物品种提供了新资源。
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