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目的:阪崎杆菌（Enterobacter sakazakii）是一种条件致病菌。它常常引起新生儿与早产儿致死性脑膜炎、脑膜脑炎、坏死性结肠炎（NEC）和败血症。致死率可达到40%-80%,虽然通过使用抗生素治疗可以使患儿康复,但常常伴有严重的神经系统后遗症及发育障碍等症状。目前仅知道婴幼儿奶粉是可能的致病菌来源。在2004年发生的安徽阜阳劣质婴幼儿配方奶粉事件,引起我国政府高度重视,并且首次从87份婴幼儿配方奶粉中分离出11株阪崎杆菌,检出率高达12.6%。到现在为止,关于阪崎杆菌的毒力因素及其致病机制了解的很少,文献提示阪崎杆菌致病原因大多和内毒素及类肠毒素有关。为了更好了解阪崎杆菌对人类的致病性,评估潜在的毒性因子是必需的。然而,关于阪崎杆菌的致病机制与病理机制目前尚不清楚。而微生物病原体成功粘附、侵袭、定居、生存在宿主的表面诸如粘膜、胃肠道的内皮细胞和上皮细胞是引起疾病的关键一步。因此,病原微生物识别和结合到细胞表面特定的受体部分是其一种普通的特性,是细菌对抗宿主限制其聚集的一种策略。因此对细胞特定的附着力,被认为是致病菌的最重要的毒性因子。细菌侵袭入脑是其致脑膜炎的关键一步。血脑屏障主要由脑微血管内皮细胞、完整基膜和神经胶质膜构成,是脑和循环系统之间的一个代谢和生理性屏障结构,血脑屏障的主要功能在于防止循环中的有毒物质比如药物、毒素等进入脑内,维持脑中内环境相对恒定,从而保护中枢神经系统受到损伤。通过体外分离培养的人脑微血管内皮细胞（HBMECs）,模拟血脑屏障,可以作为研究血脑屏障功能的理想对象。研究发现,某些致病菌可以在宿主细胞附近分泌的效应分子,引起宿主细胞内的细胞骨架变化,有利于病原菌通过宿主细胞细胞骨架的变化而粘附于宿主细胞表面、侵袭进人宿主细胞、在宿主细胞内和宿主细胞间进行迁徙,最后形成吞饮泡,避免被吞噬。细胞骨架由微丝、微管及中间纤维组成,它参与细胞的多种功能,并参与调节受体介导的信号转导,感兴趣的是,Kim KS等研究指出E.coli K1与HBMECs上的受体相互作用,在细菌的粘附处诱导肌动蛋白丝凝集。研究发现HBMECs的FAK（focal adhension kinase）、PI3K、Rho GTPase和PKC的活化等细胞骨架组装调控信号分子与E.coli K1侵袭密切相关,但是关于阪崎杆菌与HBMECs作用目前没有报道。那么阪崎杆菌是否侵袭HBMECs?在侵袭的过程细胞骨架系统是否参与?在侵袭的过程中,HBMECs的一些信号通路诸如PI3K与ERK是否活化呢?以上这些问题与阪崎杆菌的致病机理密切相关,通过对上述问题的解决,我们可以寻找预防和治疗阪崎杆菌引起的脑膜炎等相关神经系统疾病的方法,为进一步研究阪崎杆菌的致病机理打下扎实的理论基础。因此,本文主要针对上述问题的解决展开相关的实验。方法:1研究阪崎杆菌对HBMECs侵袭及其与HBMECs作用所引起细胞骨架的变化1.1细胞培养HBMECs培养于各含10%新生牛血清和胎牛血清的RPMI 1640培养液。1.2细菌培养阪崎杆菌、E44、HB101培养在含相应的抗生素的BHI培养液中。1.3阪崎杆菌的特性1.4侵袭实验检测阪崎杆菌、E44、HB101对HBMECs的侵袭能力1.5侵袭实验应用侵袭实验分析不同浓度的微丝抑制剂细胞松弛素D对阪崎杆菌侵袭HBMECs的能力的影响。1.6侵袭实验应用侵袭实验分析不同浓度的微管抑制剂秋水仙素对阪崎杆菌侵袭HBMECs的能力的影响。1.7免疫荧光检测阪崎杆菌侵袭HBMECs,HBMECs微丝的变化。1.8免疫荧光检测阪崎杆菌侵袭HBMECs,HBMECs微管的变化2探讨阪崎杆菌侵袭HBMECs依赖PI3K的活化的作用机制2.1细胞培养HBMECs培养于各含10%新生牛血清和胎牛血清的RPMI 1640培养液。2.2细菌培养阪崎杆菌、E44、HB101培养含适当的抗生素的BHI培养液中。2.3应用侵袭实验分析不同信号通路抑制剂对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响2.3.1侵袭实验分析不同浓度的PI3K抑制剂LY294002与Wortmannin对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。2.3.2侵袭实验分析不同浓度的PKC抑制剂G?6976对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。2.3.3侵袭实验分析不同浓度的Src抑制剂PP1与PP2对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。2.3.4侵袭实验分析不同浓度的ROCK抑制剂Y27632对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。2.4应用Western-blot方法检测阪崎杆菌侵袭HBMECs过程中PI3K信号分子的活化情况。2.5免疫荧光检测阪崎杆菌侵袭HBMECs,PI3K抑制剂LY294002与Wortmannin对HBMECs微丝的变化。2.6免疫荧光检测阪崎杆菌侵袭HBMECs,PI3K抑制剂LY294002与Wortmannin对HBMECs微管的变化2.7应用侵袭实验分析、Western-blot方法及免疫荧光检测PI3K缺失突变株△110对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响2.7.1应用侵袭实验分析PI3K缺失突变株△110对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。2.7.2应用Western-blot方法分析PI3K缺失突变株△110对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。2.7.3应用免疫荧光分析PI3K缺失突变株△110对阪崎杆菌侵袭HBMECs微丝的变化。2.8应用侵袭实验分析、Western-blot方法及免疫荧光检测cPLA2a在阪崎杆菌侵袭HBMECs的作用。2.8.1应用侵袭实验分析PLA2是否参与了阪崎杆菌侵袭。2.8.2利用免疫荧光化学的方法检测cPLA2a是否参与了阪崎杆菌引发的肌动蛋白的重排。2.8.3采用侵袭实验、Western-blot方法,用Akt抑制剂、AACOCF3或两种药物共同处理HBMECs研究阪崎杆菌侵袭HBMECs过程中信号通路PI3K/Akt和cPLA2a之间的关系。3探讨阪崎杆菌在侵袭HBMECs的过程中ERK活化的作用机制3.1细胞培养HBMECs培养于各含10%新生牛血清和胎牛血清的RPMI 1640培养液。3.2细菌培养阪崎杆菌、E44、HB101培养在含适当的抗生素的BHI培养液中。3.3应用侵袭实验分析不同浓度的ERK抑制剂PD98059对阪崎杆菌侵袭HBMECs的影响。3.4应用Western-blot方法检测阪崎杆菌侵袭HBMECs过程中ERK信号分子的活化情况。3.5应用免疫荧光方法检测使用ERK抑制剂PD98059预处理HBMECs后,阪崎杆菌侵袭HBMECs过程中HBMECs微丝的变化。3.6应用免疫荧光方法检测使用ERK抑制剂PD98059预处理HBMECs后,阪崎杆菌侵袭HBMECs过程中HBMECs微管的变化。3.7ERKsiRNAs瞬时转染HBMECs对阪崎杆菌侵袭HBMECs的变化。3.7.1通过脂质体转染法将ERKsiRNAs分别瞬时转染HBMECs,用Western-blot法鉴定转染细胞中ERK的表达情况。3.7.2通过脂质体转染法将ERKsiRNAs和空白对照瞬时转染到24孔板中,48h后阪崎杆菌侵袭HBMECs的变化。3.7.3通过脂质体转染法将ERKsiRNAs和空白对照瞬时转染到6孔板中,48h后免疫荧光方法检测阪崎杆菌侵袭HBMECs微丝的变化。结果:1阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞1.1阪崎杆菌的生物学特性阪崎杆菌在DFI（一种特异的显色培养基）琼脂显示蓝绿色菌落特征。1.2阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞阪崎杆菌能够侵袭人脑微血管内皮细胞,其侵袭能力与已知的脑膜炎致病菌E.coliK1的侵袭能力一样。1.3微丝抑制剂细胞松驰素D可以抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs,而不影响其粘附细胞松驰素D抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs具有剂量依赖效应。1.4微管抑制剂秋水仙素可以抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs,而不影响其粘附秋水仙素抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs具有剂量依赖效应。1.5阪崎杆菌侵袭HBMECs可以使HBMECs的细胞骨架微丝发生重排。阪崎杆菌侵袭HBMECs可引起宿主细胞骨架微丝解聚,重新分布。1.6阪崎杆菌可以使HBMECs的细胞骨架微管网断裂重排。阪崎杆菌侵袭HBMECs可引起宿主细胞骨架微管解聚,重新分布。2阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞依赖PI3K的活化2.1 PI3K抑制剂LY294002与Wortmannin明显抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs,PKC抑制剂G?6976抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs;Src、ROCK抑制剂不能阻断阪崎杆菌侵袭HBMECs。2.1.1 PI3K抑制剂LY294002与Wortmannin阻抑阪崎杆菌侵袭HBMECs,并且是以剂量依赖模式;2.1.2 PKC G?6976阻抑阪崎杆菌侵袭HBMECs,只在高浓度才有比较明显的抑制作用;2.1.3 Src抑制剂PP1与PP2不影响阪崎杆菌侵袭HBMECs;2.1.4 ROCK抑制剂Y27632不影响阪崎杆菌侵袭HBMECs。2.2阪崎杆菌侵袭HBMECs导致HBMECs的PI3K活化。2.2.1阪崎杆菌侵袭HBMECs的不同时间,Western-Blot检测Akt的磷酸化情况,发现在侵袭15min时,Akt的磷酸化明显升高。2.2.2 PI3K的抑制剂LY294002或wortmannin预处理HBMECs 30min后,发现Akt的磷酸化没有变化。2.3 PI3K抑制剂可以消除阪崎杆菌侵袭HBMECs时的微丝变化。2.4 PI3K抑制剂可以消除阪崎杆菌侵袭HBMECs时的微管变化。2.5 Dominant-negative PI3K（Δp110）可以抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs,并能消除阪崎杆菌所引起的F-actin变化以及Akt的磷酸化。2.5.1侵袭实验:检测阪崎杆菌侵袭PI3K缺失突变的HBMECs（即PI3K△P110）的能力,结果发现Δp110可以明显地抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs。2.5.2 Western-blot方法:检测PI3K缺失突变的HBMECs（即PI3K△P110）在阪崎杆菌侵袭HBMECs时的表达情况。结果发现Δp110能抑制阪崎杆菌引起的Akt的磷酸化。2.5.3荧光方法观察阪崎杆菌侵袭PI3K缺失突变株的HBMECs（PI3K/△P110）的细胞骨架—微丝的变化,结果证实Δp110能消除阪崎杆菌所引起的F-actin变化。2.6 cPLA2a与阪崎杆菌侵袭HBMECs有关。并且阪崎杆菌侵袭HBMECs时会激活cPLA2a。2.7 cPLA2a是PI3K/Akt信号通路中阪崎杆菌侵入HBMECs的下游效应物。3阪崎杆菌侵袭人脑微血管内皮细胞与ERK的活化有关3.1 ERK抑制剂PD98059抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs。ERK抑制剂PD98059阻抑阪崎杆菌侵袭HBMECs,并且是以剂量依赖模式3.2阪崎杆菌侵袭HBMECs导致HBMECs的ERK活化。3.2.1阪崎杆菌侵袭HBMECs的不同时间,Western-Blot检测ERK的磷酸化情况,发现在侵袭10min时,ERK的磷酸化明显升高。3.2.2 ERK的抑制剂PD98059预处理HBMECs30min后,发现ERK的磷酸化不发生变化。3.3 ERK抑制剂可以消除阪崎杆菌侵袭HBMECs时的微丝变化。3.4 ERK抑制剂可以消除阪崎杆菌侵袭HBMECs时的微管变化。3.5 ERK siRNAs瞬时转染到HBMECs后,可抑制阪崎杆菌侵袭HBMECs,而且可以消除阪崎杆菌侵袭HBMECs时的微丝变化。结论:阪崎杆菌侵袭进入HBMECs依赖于HBMECs细胞骨架的重排;通过PI3K活化,引起HBMECs的细胞骨架变化,促进阪崎杆菌侵袭HBMECs;阪崎杆菌侵袭HBMECs还与ERK的活化有关,ERK活化也导致HBMECs的细胞骨架变化,但PI3K与ERK活化的关系及具体机制还有待进一步探讨。