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背景:心肌缺氧损伤(myocardial hypoxia injury)是心血管病的主要病理基础,到目前为止,它的发病机制未完全阐明,并且临床上无有效且特异性的药物治疗。已有研究显示,中医药在治疗心肌缺氧损伤方面具有独特的优势,并且国内外开展了大量相关的临床与基础研究。研究证明,豨莶草水提物及醇提物均具有舒张血管、降压、镇痛、抗菌消炎、抗氧化和抑制免疫功能等药理作用,常用于心脑血管疾病的临床治疗。临床上含有豨莶草的成方以及中成药中,豨莶草的炮制方法各有不同,目前缺乏豨莶草生品和酒制的药效学比较及心肌缺氧保护机制的研究。通过比较酒制和生豨莶草在H9c2细胞缺氧损伤中对细胞内乳酸脱氢酶(LDH)漏出率、超氧化物歧化酶(SOD)含量、活性氧(ROS)的活性、细胞凋亡蛋白(Bcl-2,Bax)评价豨莶草不同炮制品的药效学差异,并通过网络药理学筛选出活性成分和靶点并进行细胞水平的实验验证。方法:1实验一:H9c2心肌细胞株的培养和缺氧模型的建立以大鼠H9c2心肌细胞为研究对象,于三气培养箱(1%O2、5%CO2、94%N2)中以不同的缺氧时间(12h,16h,20h,24h,48h)作用于心肌细胞,通过Cell Counting Kit-8(CCK-8)法检测细胞存活率,筛选出合适的缺氧时间,建立H9c2心肌细胞缺氧模型。2实验二:酒制和生豨莶草对H9c2心肌细胞缺氧损伤的药效比较研究通过CCK-8法检测细胞药物毒性,筛选出实验用生豨莶草和酒制豨莶草冻干粉药物浓度。随机分为正常组、模型组、生豨莶草和酒制豨莶草组,造模给药后,采用CCK-8法测定细胞活力,比色法测定LDH漏出率、SOD活力、ROS活性,Western Blot检测心肌细胞的Bcl-2、Bax蛋白表达水平。3实验三:豨莶草治疗心肌缺氧损伤网络药理学研究采用中药系统药理学技术平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)和既往文献报道,通过口服利用度和药物相似性筛选豨莶草的活性成分,通过Swiss Target Prediction整合靶点构建豨莶草有效成分潜在的作用靶点信数据集,通过Gene card和OMIM数据库筛选治疗心肌缺氧损伤疾病的作用靶点,利用String数据库和Cytoscape软件来绘制蛋白质相互作用网络,通过R对豨莶草作用靶点进行信号通路和基因本体分析。4实验四:生豨莶草及其活性成分奇壬醇、豨莶精醇对H9c2细胞缺氧损伤的药效作用及其对JAK2/STAT3信号通路的影响结合网络药理学和文献报道,以生豨莶草及其活性成分奇壬醇、豨莶精醇为研究对象,通过CCK-8法检测细胞药物毒性,筛选确定实验用奇壬醇、豨莶精醇药物浓度;基于H9c2缺氧损伤模型,随机分为空白对照组、模型组、生豨莶草组、奇壬醇组、豨莶精醇组,采用比色法测定LDH漏出率,评价其药效作用,Western Blot检测心肌细胞JAK2、STAT3蛋白表达水平,初步阐释其缺氧保护的作用机制。结果:1实验一:H9c2心肌细胞株的培养和缺氧模型的建立H9c2细胞缺氧16h～48h可显著降低细胞存活率。H9c2细胞缺氧16h,细胞存活率为48.39%,细胞存活率降低程度适中,实验结果重复性好(n=6),因此选择16h来建立细胞缺氧损伤模型。2实验二:酒制和生豨莶草对H9c2心肌细胞缺氧损伤的药效比较研究(1)CCK-8药物毒性结果显示:与正常组相比,酒制和生豨莶草给药浓度在500μg·ml-1以下未见细胞毒性,因此在后续实验中,SHS和JHS均采用500,300,l00μg·m-1为药物干预浓度。(2)LDH漏出率,SOD活力,ROS含量,细胞活力结果显示:与正常组比较,模型组LDH漏出率增加(P<0.05),ROS含量增加(P<0.05),SOD活力降低(P<0.05),细胞活力降低(P<0.05)。与模型组比较,SHS组和JHS组均能降低细胞内ROS的含量和LDH外漏(P<0.05),增加SOD活力和细胞活力(P<0.05)。SHS组和JHS组比较:SHS组细胞存活率、SOD活力和LDH漏出率高于JHS组(P<0.05);ROS水平两组之间没有显著差异。(3)Western Blot结果显示:与正常组比较,模型组Bcl-2表达下调(P<0.05),Bax表达上调(P<0.05),Bcl-2/Bax 比值下调(P<0.05);与模型组比较,SHS组和JHS组均可上调Bcl-2的表达(P<0.05),上调Bcl-2/Bax的比值(P<0.05),但Bax值未见明显差异;将SHS组与JHS组的Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax值进行比较,两组之间未见显著差异。3实验三:豨莶草治疗心肌缺氧损伤的网络药理学研究豨莶草中有10个主要活性成分(常春藤皂苷元、豆甾醇、β-谷甾醇、豨莶精醇、斑鸠菊酸、冠狗牙花定、莶酯酸Ⅱ、豨莶醚酸、奇壬醇等),360个相关靶基因,筛选出治疗心肌缺氧的靶基因205个,豨莶草治疗心肌缺氧的关键化合物有冠狗牙花定碱、豆甾醇、β-谷甾醇、常春(藤苷)配基等,关键靶点主要是IL-6、MAPK3、VEGFA、SRC、CASP3、MAPK1、EGFR、TP53、PTGS2、STAT3、MAPK1、JUN、MTOR、PIK3CA、ESR1、MMP9、MAPK114、F2、FGF2、ACE、IL-2、PPARG、KDR、MMP2、AK、MDM2、NR3C1、Bc12Cl、JAK2、AGTR1等。豨莶草治疗心肌缺氧损伤的基因功能主要调节G蛋白偶联受体,钙离子的转运,神经突触和受体之间的关系,心肌对肾上腺素、乙酰胆碱、5羟色胺等接收的生物学过程。通路主要有癌症途径、细胞凋亡、钙离子信号通路、p53信号通路、cGMP-PKG信号通路等。4实验四:生豨莶草及其活性成分奇壬醇、豨莶精醇对H9c2细胞缺氧损伤的药效作用及其对JAK2/STAT3信号通路的影响(1)CCK-8药物毒性结果显示:与正常组相比,给药浓度在l0μ g·ml-1细胞存活率最高,给药浓度在10μg·ml-1至50μg·ml-1之间细胞存活率正常,因此在后续实验中,奇壬醇和豨莶精醇均采用10μg·ml-1为药物干预浓度。(2)LDH漏出率结果显示:H9c2细胞缺氧16h后,与正常组比较,模型组LDH外漏显著增加(P<0.01),与模型组比较,生豨莶草、奇壬醇、豨莶精醇均能明显降低LDH外漏(P<0.01),但是三组之间LDH漏出率没有显著差异。(3)Western Blot结果显示:与正常组比较,模型组STAT3和JAK2表达下调(P<0.05);与模型组比较,生豨莶草、奇壬醇、豨莶精醇均可上调STAT3和JAK2的表达(P<0.05),但是三组之间JAK2和STAT3的表达没有显著差异。结论:本研究通过比较不同缺氧时间对H9c2细胞缺氧状态的影响,确定16h为缺氧造模时间。通过比较LDH漏出率、SOD活力、ROS含量以及Bax、Bcl-2蛋白表达含量,初步评价了生豨莶草和酒制豨莶草两种品种在治疗心肌缺氧损伤的方面疗效差异,生豨莶草略优于酒制豨莶草。采用网络药理学结合文献报道的方法筛选出豨莶草心肌保护的活性成分和蛋白靶点,并进行了细胞水平的实验验证,豨莶草中奇壬醇、豨莶精醇具有较好的缺氧保护作用,其作用机制可能通过JAK2/STAT3通路发挥心肌缺氧保护作用。