水凝胶作为一种含水量高的高分子网络材料,被广泛应用于各种组织修复中,如伤口敷料、软骨修复、骨缺损填充材料等。其中,以天然高分子材料（如明胶、壳聚糖、透明质酸和海藻酸钠）制成的水凝胶具有更为突出的生物相容性。此外,通过对天然高分子链进行修饰,例如接枝细胞黏附位点或交联位点,可在体外构建类似于天然胞外基质的三维（Three dimension,3D）细胞培养平台。目前,细胞培养方式大部分都是基于二维（Two dimension,2D）平面的,虽然能够简易且大量地扩增所需细胞,但却会造成一些细胞表现出异常（较之体内）的生物学行为。传统的细胞体外培养大多基于聚苯乙烯和玻璃材质的培养板/瓶之上,这些材料所表现出来的弹性模量是非生理范围内的,因此将会造成细胞表现出异常的行为,例如较为扁平的形态、异常的极化、对于小分子药物反常的应答（敏感或不敏感）以及表型的变化等等。这些异常细胞应答的原因不仅仅来自于基底非生理范围内的硬度影响,还来自于细胞整合素分布的影响;在正常生理条件下,细胞能够从胞外基质环境中接收化学/物理信号,接收范围是360°的,而不同于2D平面上仅限于细胞背腹面的信号传递。因此,以水凝胶（含水量高的聚合物网络结构）为基础的体外细胞培养体系是一种最优的选择之一。天然高分子水凝胶不但能够作为细胞体外培养平台,也能够成为揭示胞外基质物理特性对细胞行为调控作用机制的有力工具。近年来,越来越多的研究揭示了胞外基质的物理因素对细胞重要的调控作用,诸如胞外基质的硬度、拓扑结构、黏弹性、孔隙率和降解率等,不可否认的是,同可溶性化学因子的作用一样,胞外基质的物理特性也举足轻重。天然高分子水凝胶不但具备了高的生物相容性,也拥有多种天然胞外基质特有的物理特性;且基于水凝胶的3D培养体系将会为基础细胞研究引入更多的物理变量。这些物理特性往往相互联系、相互依赖,如何单一调控某一物理特性的变化是目前研究的难点。海藻酸钠水凝胶作为天然高分子水凝胶之一,具有极优的生物相容性和人工可修饰性,其分子链由β-D-甘露糖醛酸（β-D-Mannuronic,M）和α-L-古洛糖醛酸（α-L-guluronic,G）按α（1-4）糖苷键键合而成,在有二价阳离子存在的条件下,分子链中的G单元同二价阳离子形成螯合交联网络结构。这种物理的交联方式被成为―蛋盒‖样交联。利用其与钙离子螯合交联的特性,可在一定范围内单一调控水凝胶的硬度、黏弹性特征而不影响其内部孔隙结构。因此,海藻酸钠水凝胶可用以探明单一物理特性如何影响细胞生物学功能,这不但有利于我们更好利用天然高分子水凝胶,还为细胞如何响应单一胞外基质的物理特性变化提供更贴近体内环境的参考数据。骨髓间充质干细胞（Mesenchymal stem cells,MSCs）由于其优越的多向分化潜能、可获得性高、免疫排斥性小以及不涉及伦理道德等问题,已成为组织工程修复过程中重要的种子细胞之一。MSCs所处的微环境十分复杂,涉及多种化学因子和物理因素的协同作用,正常生理条件下,骨髓微环境会不断的进行重组用以维稳干细胞,使其保持在最低耗能状态。不同于体内已经成熟分化的体细胞,干细胞的有丝分裂次数有限,因此在整个细胞生命周期中,其大部分时间都处于沉默状态。当体内损伤发生,干细胞被动员后,会通过短/长距离的迁移到达损伤部位,从而参与组织修复。这个过程十分复杂,涉及化学因子和物理因子的多因素共同作用。在过去的几十年中,化学因子对于干细胞的生物学功能的影响（迁移、增殖、旁分泌和分化）被大量关注并研究,而近年来,胞外基质的物理特性开始被注意并深入研究。但目前对于胞外基质物理特性和干细胞生物学响应的相关研究大多基于2D培养条件下,虽然这些研究也能够为我们了解干细胞提供重要的参考,但如前所述,由于2D培养同体内环境的巨大差异,基于此的研究结果依旧存在局限性。相比之下,体外的3D培养更类似于体内环境。事实上,已有大量研究报道过不同的培养维度对细胞生物学应答产生的影响,有时不同的培养维度甚至可以带来相反的实验结果。鉴于此,我们的研究致力于利用海藻酸钠水凝胶为基础的3D细胞培养系统,探讨干细胞对于胞外基质物理特性,包括硬度、黏弹性的响应方式,并试图阐明其中的分子机制,为水凝胶的设计、优化提供理论基础;同时,也为体外研究干细胞生物学行为提供更贴近生理条件的模型。主要研究内容及结果如下:（1）3D培养环境下,干细胞通过迁移策略的转变和细胞核硬度的降低来应对胞外基质硬度的上调通过调节海藻酸钠的分子量和钙离子交联浓度,结合Transwell小室构建体外3D细胞趋化性迁移模型,在此模型下探究不同的胞外基质硬度对干细胞迁移行为的影响。我们的研究发现,较硬的胞外基质能够促进干细胞在三维条件下的迁移。这种迁移能力的提高伴随着整合素和基质金属蛋白酶表达的降低,然而促干细胞迁移相关分子—基质细胞衍生因子（Stromal cell derived factor-1,SDF-1）和趋化因子受体4（CXC-chemokines receptor-4,CXCR4）的表达得到显著上调。该结果表明,干细胞获得了较强的迁移能力,但这种迁移能力不依赖于整合素和蛋白酶水解胞外基质来获得;此外,Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiled coil containing protein kinase,ROCK）抑制剂的加入能够显著抑制较硬的胞外基质促进的细胞迁移上调。上诉结果指出,较硬的胞外基质可能通过转变干细胞的迁移策略来获得更强的运动性。在这个过程中,较硬的胞外基质还能够显著下调细胞核骨架蛋白核纤层蛋白A/C（Lamin A/C）的表达,从而软化细胞核,使细胞获得更大的变形性,有助于细胞穿过3D基质中狭小的缝隙。综上所述,干细胞能够通过转变自身的迁移策略来应对胞外基质机械性能的变化,从而获得最优的运动能力。（2）3D动态胞外基质能够通过提高细胞摄入的有效机械剂量促进干细胞的旁分泌功能通过调节海藻酸钠水凝胶的不同硬化时间点,构建了在不同时间点变化的胞外基质,用以考察不同硬化时间点对于干细胞旁分泌功能的影响。我们的研究发现,较之静态的胞外基质,动态的胞外基质更能够提高干细胞的旁分泌水平,尤其是在第三天硬化的胞外基质中,干细胞的旁分泌水平较之其他组更为旺盛。随后的研究指出,前期较软的胞外基质能够有效促进干细胞的伸展,使得干细胞与胞外基质获得更有效的结合,从而有利于干细胞将胞外基质的机械信号传导到胞内转化为化学信号,并最终调控基因的表达,有效提高干细胞的旁分泌水平。在此研究中,我们提出,胞外基质的物理特性对于干细胞而言,存在―总机械剂量‖和―有效机械剂量‖两个概念,并且胞外基质对干细胞施加的总机械能通过YAP（Yes-associated protein,YAP）蛋白的核质穿梭转化为有效机械剂量来调节基因的表达。（3）较硬的胞外基质能够通过提高干细胞的皮质层活性来维持细胞分裂胞外基质的物理限制对于细胞的分裂存在巨大的影响。我们研究了干细胞在不同硬度的胞外基质中的增殖活性。通过干细胞的全转录组测序后发现,较硬的胞外基质能够有效促进干细胞的基因表达,并且两者的差异基因主要集中在细胞周期相关信号通路中。随后的研究指出,较硬的胞外基质能够有效促进干细胞的增殖活性。我们的研究提出,在3D条件下干细胞在有丝分裂过程中,Ras和肌球蛋白II（Myosin II）表达量上调造成的细胞皮质层活性加强有利于干细胞在分裂过程中抵抗胞外基质的物理限制,从而保护有丝分裂的正常进行。而在这个过程中,干细胞的整合素表达下调可能有利于细胞在有丝分裂过程中有效地脱基质变圆,为DNA和蛋白质的合成提供所需的空间。（4）胞外基质的黏弹性通过PI3K/Akt-CDK1轴平衡干细胞的自我更新和沉默本研究中,我们利用不同分子量的海藻酸钠和钙离子交联浓度来获得硬度相似但黏弹性不同的水凝胶。通过对干细胞全转录组的分析后发现,不同的应力松弛能够明显改变干细胞基因的表达,并且显著影响干细胞的自我更新能力。我们的研究提出,在3D培养条件下,干细胞通过PI3K/Akt-CDK1轴维持自我更新,但当胞外基质不足以为干细胞分裂提供所需的空间时,干细胞能够通过下调PI3K/Akt-CDK1轴的活性来进入沉默状态,而从沉默状态再激活的干细胞具有更高的增殖/分化活性。