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仔猪细菌性腹泻是规模化养猪场较为常见的一类传染性疾病,其中F18大肠杆菌（Escherichia coli F18,E.coli F18）是引起断奶仔猪细菌性腹泻的主要病原,目前关于猪对E.coli F18抗性调控机制还有待深入阐明。随着分子生物学研究的不断深入,RNA新的功能和调控机制不断被发现,N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine,m6A）是RNA甲基化中最丰富的修饰方式之一,研究表明m6A甲基化修饰在病毒复制、细菌感染及免疫反应等生物学过程中发挥着重要的作用。然而,关于m6A修饰对猪F18大肠杆菌抗性的转录后调控机制尚处于空白。本研究以猪小肠上皮细胞系（IPEC-J2）为主要研究模型,首先系统验证了猪 m6A 甲基化酶 Wilms 瘤相关蛋白（Wilms tumorl associating protein,WTAP）表达对F18大肠杆菌抗性的作用关系,其次利用比较转录组学测序对WTAP干扰前后组以及F18大肠杆菌感染IPEC-J2细胞前后组进行差异表达基因联合筛选,鉴定WTAP调控的关键靶基因;利用MeRIP-qPCR、点突变、双荧光素酶、RIP-qPCR等实验探究猪WTAP介导m6A修饰对靶基因表达的调控机制,最终影响IPEC-J2细胞对大肠杆菌易感性。主要研究结果如下:1.为了探究WTAP表达与大肠杆菌感染的关系,本研究利用qRT-PCR检测了WTAP在梅山猪F18大肠杆菌抗性型与易感型十二指肠、空肠组织中的表达情况,发现抗性型肠道组织中WTAP表达量均极显著高于易感型个体（P＜0.01）;利用F18ab和F18ac菌株分别刺激IPEC-J2细胞前后,WTAP基因mRNA和蛋白表达均发生极显著上调（P＜0.01）。间接免疫荧光分析显示,WTAP蛋白主要定位在细胞核中,并且F18大肠杆菌感染后其分布水平明显上升。本研究成功构建了WTAP慢病毒稳定干扰的IPEC-J2细胞系,干扰效率为53.68%,并通过菌毛蛋白定量、菌落计数、革兰氏染色、间接免疫荧光和扫描电镜等试验系统评估WTAP基因表达水平变化对F18大肠杆菌体外黏附水平的影响。结果显示,在IPEC-J2细胞中敲降WTAP基因后,F18大肠杆菌黏附细胞的数量明显增加,表明WTAP可能作为调控猪小肠上皮细胞对E.coli F18易感性的关键m6A甲基化酶,并且WTAP上调表达有利于提高猪对大肠杆菌感染的抵抗能力。2.为了鉴定WTAP靶向调控的关键功能基因,本研究利用RNA-seq技术对WTAP干扰前后（siWTAP、siCtrl）和大肠杆菌感染前后（E.coli、Control）的IPEC-J2细胞进行转录组测序分析。结果显示,在siWTAP和siCtrl组之间筛选323个差异表达基因（DEGs）,大肠杆菌感染组和对照组之间筛选出211个差异表达基因,两组之间存在25个共同DEGs。KEGG富集分析显示,WTAP干扰前后DEGs主要富集于促IgA肠道免疫、抗原加工及呈递、鞘糖脂生物合成、CAMs信号等信号通路;大肠杆菌感染前后DEGs主要富集于Wnt信号通路、细胞补体信号通路、鞘糖脂生物合成通路等,两者存在1 1个共同的信号通路。qRT-PCR和Western blot验证发现,WTAP干扰前后以及大肠杆菌感染前后,GCNT2基因mRNA和蛋白表达均呈现极显著的上调,由此表明,GCNT2基因可能作为WTAP调控大肠杆菌易感性的潜在靶向基因。3.为了探究WATP介导m6A修饰对GCNT2的调控机制,本研究首先利用生物信息学软件针对GCNT2基因的m6A修饰位点进行预测,发现存在2个潜在的m6A修饰位点（m6A-3294、m6A-3467）;其次利用MeRIP-qPCR实验验证发现,GCNT2基因m6A-3467处修饰水平在WTAP干扰组和对照组之间无显著差异（P＞0.05）,而m6A-3294处修饰水平在WTAP干扰组出现极显著下降（P＜0.01）。分别构建GCNT2 m6A修饰位点的野生型（WT）和突变型载体（Mut）、WTAP干扰（siWTAP）和对照载体（siCtrl）、YTHDF2干扰（siYTHDF2）和对照载体（siCtrl）,双荧光素酶活性检测发现,GCNT2-WT组中GCNT2活性在siWTAP和siCtrl组,siYTHDF2和siCtrl均存在极显著差异（P＜0.01）,而GCNT2-Mut组中GCNT2活性在不同处理组间均无显著差异（P＞0.05）。RIP-qPCR验证显示,YTHDF2蛋白与GCNT2存在明显的结合关系;构建YTHDF2干扰和过表达重组质粒,qRT-PCR和Western blot验证验证其干扰和过表达效率,并且发现YTHDF2干扰后,GCNT2 mRNA和蛋白表达水平均极显著上升,而YTHDF2过表达后,GCNT2表达极显著下降（P＜0.01）,在siWTAP组加入OE-YTHDF2后出现下调趋势。放线菌素D（actinomycin D）分别处理OE-YTHDF2和OE-Ctrl组IPEC-J2细胞不同时间点（0 h、3 h、6 h）,qRT-PCR检测发现OE-YTHDF2 mRNA表达下降趋势更为明显,表明YTHDF2影响GCNT2的mRNA稳定性。功能验证显示,GCNT2干扰后大肠杆菌F18黏附细胞的数量明显减少,并且鞘糖脂生物合成通路的相关基因ABO、FUT1、FUT2、FUT2A表达量均出现极显著下调（P＜0.01）。由此表明,WTAP介导m6A修饰对GCNT2基因表达具有调控作用,GCNT2参与鞘糖脂生物合成通路在E.coli F18感染猪小肠上皮细胞的过程中发挥了重要的作用。综合上述研究结果,WTAP可能依赖m6A识别蛋白YTHDF2靶向调控GCNT2基因,通过影响其mRNA稳定性来降低GCNT2基因表达水平,进而抑制大肠杆菌受体形成相关信号通路-鞘糖脂生物合成,最终有利于猪小肠上皮细胞一定程度上抵御大肠杆菌F18的侵染。