嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是一种重要的人-兽-鱼共患病病原。在自然环境中该茵大多以生物被膜形式存在,该存在形式作为一种同浮游细菌相对应的生长方式,在细菌的致病过程中发挥重要作用。现有的研究主要集中在嗜水气单胞菌生物被膜耐药性及疫苗方面,而毒力及生物被膜形成能力的关系以及生物被膜状态下与浮游态细菌蛋白表达差异的研究,国内外尚属空白。本研究观察了嗜水气单胞茵体外生物被膜的结构特征及形成过程,比较了生物被膜状态同浮游态细菌蛋白表达的差异,研究了生物被膜形成相关蛋白OmpAⅡ、FlaA、Omp38及LuxS勺生物学功能。1.嗜水气单胞菌生物被膜形成能力分析及其与毒力关系结合FITC-conA、FDA/PI荧光染色技术,对生物被膜的不同成分进行染色,利用荧光显微镜、扫描电镜及激光共聚焦显微镜观察不同时间生物被膜的结构特征及形成过程；同时将绿色荧光蛋白(GFP)表达载体导入嗜水气单胞菌,利用GFP标记技术示踪嗜水气单胞茵体外生物被膜的形成。结果显示,嗜水气单胞菌培养8h后聚集形成微菌落团,24h后生物被膜具有一定的厚度,且随时间延长,生物被膜厚度增加,死菌比例增加。气单胞茵不同分离株生物被膜的形成能力分析显示,86.7%(100/113)的气单胞茵菌株可形成生物被膜。通过选取生物被膜形成能力不同的菌株进行斑马鱼攻毒试验,结果表明生物被膜形成能力与菌株的致病性呈明显正相关。2.嗜水气单胞菌浮游态和生物被膜状态比较蛋白质组学研究利用比较蛋白质组学的方法,研究了嗜水气单胞菌J-1浮游态与生物被膜状态全菌蛋白及外膜蛋白的表达差异。结果表明,生物被膜状态下全菌蛋白中,17种蛋白表达上调,另有17种蛋白表达下调；而外膜蛋白中,11种蛋白表达上调,1种蛋白表达下调。采用嗜水气单胞菌鲫鱼感染血清与上述两种状态细菌的外膜蛋白进行免疫蛋白质组学分析,发现7种蛋白在两种状态均具有较强的免疫反应性,其中6种蛋白在生物被膜状态下表达升高,1种蛋白仅在生物被膜状态下具有免疫反应性。结果表明生物被膜状态下的细菌与浮游态相比,蛋白表达存在一定的差异,所鉴定的具有免疫反应性的蛋白作为疫苗侯选抗原,在抵抗嗜水气单胞菌持续性感染中具有较好的应用前景。3.嗜水气单胞菌主要外膜蛋白OmpAⅡ的生物学功能分析了嗜水气单胞菌生物被膜相关基因ompAII序列及其在252株不同气单胞菌中的分布,同时利用同源重组技术构建了ompAⅡ基因缺失株,通过比较野生株、缺失株的生物学特性,阐述主要外膜蛋白OmpAⅡ在嗜水气单胞菌致病过程中所发挥的作用。序列分析结果表明,基因ompAⅡ开放阅读框(ORF)为1002bp,编码333aa的主要外膜蛋白OmpAⅡ,该蛋白具有微孔蛋白超家族及OmpA蛋白家族的特性。基因ompAⅡ在嗜水气单胞菌中的分布率为83.3%(60/72)。ompAⅡ基因缺失株胞外产物溶血活性、溶蛋白活性及细胞毒性均有明显降低,生物被膜的形成能力也有所下降。此外,缺失株的黏附能力及抵抗巨噬细胞RAW264.7的吞噬能力与亲本目比,分别降低了25%和33%,据此可以推测嗜水气单胞菌的OmpAⅡ可能与该菌的黏附有关。以上研究结果揭示主要外膜蛋白OmpAⅡ是嗜水气单胞菌重要的毒力因子,在嗜水气单胞茵对宿主细胞的黏附过程中发挥作用。4.嗜水气单胞菌鞭毛蛋白FlaA的生物学功能分析了嗜水气单胞茵生物被膜相关基因flaA序列及其在252株不同气单胞茵中的分布,同时利用同源重组技术构建了flaA基因缺失株,通过比较野生株、缺失株的生物学特性,阐述鞭毛蛋白FlaA在嗜水气单胞茵致病过程中发挥的作用。序列分析结果表明,基因flaA ORF为909bp,编码302aa的鞭毛蛋白FlaA.从FlaA进化途径上看,嗜水气单胞菌J-1株FlaA位于气单胞茵属FlaA第2群中。flaA基因在嗜水气单胞菌中的分布率为55.6%(40/72),与其他气单胞菌属细菌的鞭毛蛋白的同源性在88%-99%之间。flaA基因缺失株、互补株及野生株的生物学特性比较结果表明,毒力基因aer和vgrG3的表达下调为野生株的0.44和0.45倍,该菌株的溶血活性显著下降。此外,缺失株生物被膜的形成能力降低,为野生株的85%。flaA基因缺失株对HEp-2细胞的黏附能力降低了48%,其茵体和上清液对巨噬细胞RAW264.7的毒性作用分别降低了35%和55%。研究结果表明,鞭毛蛋白FlaA与细菌的黏附作用密切相关,且在生物被膜形成过程中发挥重要作用。5.嗜水气单胞茵外膜蛋白Omp38的生物学功能分析了嗜水气单胞菌生物被膜相关基因omp38及其在252株不同气单胞菌中的分布,同时利用同源重组技术构建了omp38基因缺失株,通过比较野生株、缺失株的生物学特性,阐述外膜蛋白Omp38在嗜水气单胞菌致病过程中发挥的作用。序列分析结果表明,基因omp38ORF为1074bp,编码357aa的微孔蛋白为Omp38,属于微孔蛋白超家族。omp38基因在嗜水气单胞菌中的分布率为,73.6%(53/72)。通过结晶紫染色、激光共聚焦显微镜观察发现缺失株生物被膜的形成能力显著增强,FITC-conA标记后荧光显微镜观察发现生物被膜多糖的产生能力显著增强。噬菌体敏感试验表明,omp38基因缺失株使噬菌体的增殖能力降低,推测Omp38可能是细菌表面噬菌体受体。omp38基因缺失后细菌的溶血活性及溶蛋白活性降低,可能与aer、ahe2、 emp的表达下调有关。omp38基因缺失株对HEp-2细胞的黏附能力、抵抗血清杀菌能力及抗巨噬细胞的吞噬能力均显著增强,分别为野生株的11.45、10和1.73倍,这可能与多糖的保护作用有关。同时缺失株细菌及上清液对巨噬细胞RAW264.7的毒性分别增加19%和10%。此外,缺失株Ⅵ型分泌系统(T6SS)的vgrG2基因表达上调为亲本株的3.4倍。上述结果表明omp38基因缺失可引起嗜水气单胞菌毒力增强。6.嗜水气单胞菌J-1株ompAⅡ和omp38双基因缺失株的构建及生物学特性分析利用接合转移技术在omp38基因缺失株的基础上构建了ompAⅡ-omp38双基因缺失株,并对缺失株与野生株的生物学特性进行了比较。结果显示,缺失株具有较好的遗传稳定性,生长能力显著增强。荧光定量PCR结果显示,缺失株毒力基因aer的表达量下调为亲本株的0.83,而ahe2、emp、hcp2、vgrG2的表达量上调为亲本株的1.60、1.49、1.71、4.46倍。缺失株溶血活性的降低及溶蛋白活性的增强,可能与其毒力基因aer表达量下调及ahe2、emp表达量上调有关。此外,ompAⅡ与omp38双基因的缺失使得细菌抵抗血清杀菌能力及细胞毒性增强,而对HEp-2细胞的黏附能力及对巨噬细胞RAW264.7抗吞噬能力则表现为降低。以上结果表明,双基因缺失株的特性并非是ompAⅡ及omp38单基因缺失株特性的简单加合。7.嗜水气单胞茵J-1株luxS基因缺失株的生物学特性分析群体感应(QS)系统luxS基因缺失后,细菌的生物被膜形成能力显著降低,这与QS系统在生物被膜形成过程中发挥的作用密切相关。荧光定量PCR结果显示,缺失株所有毒力基因表达均下调,其中aer、ahe2、emp、hcp2的表达量显著下调为亲本株的0.14、0.21、0.06、0.24倍,这与细菌溶血活性及溶蛋白活性显著降低相一致。缺失株对细胞的黏附能力及菌体、上清对细胞的毒性显著降低,分别为野生株的84%、85%、48%。以上结果表明,LuxS参与调控细菌的毒力,与细菌生物被膜的形成有关。8.嗜水气单胞菌Omp38重组蛋白的动物免疫效果评价嗜水气单胞菌重组蛋白Omp38抗血清可与76%(47/62)的不同血清型嗜水气单胞菌外膜蛋白反应,表明其是一种潜在的共同保护性抗原。将重组蛋白Omp38分别注射免疫小鼠、鳊鱼,评价其免疫效果。结果表明,小鼠免疫后灭活疫苗组(I组)及蛋白免疫组(II组)IgG抗体水平显著高于对照组(III组),第35d达到最高。腹腔巨噬细胞吞噬活性及脾淋巴细胞转化能力均呈增加趋势,与血清IgG抗体产生水平基本一致。免疫后42d脾脏淋巴细胞中CD3+、CD3+CD4+CD8所占比率最高,I组为65.17%、52.08%,II组为53.22%、39.58%。荧光定量PCR分析结果表明免疫后21d开始,免疫组淋巴细胞IFN-y及IL-4mRNA表达水平上调,35d达到最高。鳊鱼免疫后,灭活疫苗组(I组)及蛋白免疫组(II组)IgM抗体水平显著高于对照组(III组),21d达到最高,此时Ⅱ组抗体水平高于I组,之后一直维持在较高水平。各免疫组血清超氧化物歧化酶(SOD)活性在免疫初期变化较为明显,14d II组SOD活性显著高于Ⅲ组(P<0.05),21d时SOD活性达到最高。各免疫组血清溶茵酶(LSZ)活性在14d呈现较高水平,且Ⅰ组高于Ⅱ组(P<0.05),之后呈现波动且高于同时间点III组LSZ活性(P<0.05)。流式细胞仪及平板计数结果表明各免疫组鳊鱼头肾细胞吞噬活性显著高于Ⅲ组(P<0.05)。免疫保护试验显示,Ⅰ组、Ⅱ组小鼠分别获得了82.00%、58.82%的相对保护率；Ⅰ组、Ⅱ组鳊鱼分别获得了50.00%、57.14%的相对保护率.结果表明,重组蛋白Omp38能够有效地刺激机体产生体液免疫应答及细胞免疫应答,对小鼠及鳊鱼的嗜水气单胞茵感染具有较好的免疫保护效果.